结构与功能比较研究

启动子是基因在转录水平上的一种重要调控元件。本研究通过同源序列法从甘蓝型油菜品种中油８２１ 中分离到油菜基因ＮａｐＢ和ＦＡＥ１的上游启动子序列ｐＮａｐＢ和ｐＦＡＥ１,其中ｐＮａｐＢ长１１３６ｂｐ,ｐＦＡＥ１长１４２０ｂｐ。 两种启动子的核苷酸序列都含有种子特异表达启动子的顺式作用元件,包括ＲＹ重复、Ｇ－ｂｏｘ和Ｅ－ｂｏｘ等,但两 种启动子顺式作用元件的序列分布不同。将ｐＮａｐＢ和ｐＦＡＥ１两个启动子分别与报告基因ＧＵＳ融合并通过农杆菌 介导法导入烟草,得到大量转基因烟草植株。对Ｔ１代转基因烟草进行组织化学分析,比较了不同启动子的组织表 达特异性。结果表明,两种启动子都只在种子中起作用,属于典型的种子特异性表达启动子,但是它们作用的时间 和空间分布以及作用强度明显不同。ｐＮａｐＢ启动子比ｐＦＡＥ１作用开始的时间早,持续时间长,在早期作用比 ｐＦＡＥ１强,但ｐＦＡＥ１启动子在种子发育中期启动速度快,成熟种子的ＧＵＳ染色深度在两种启动子间差别不大。     

油菜种子特异表达启动子pNapB和pFAE1的结构与功能比较研究

启动子是基因在转录水平上的一种重要调控元件。本研究通过同源序列法从甘蓝型油菜品种中油821中分离到油菜基因NapB和FAE1的上游启动子序列pNapB和pFAE1,其中pNapB长1136bp,pFAE1长1420bp。两种启动子的核苷酸序列都含有种子特异表达启动子的顺式作用元件,包括RY重复、G-box和E-box等,但两种启动子顺式作用元件的序列分布不同。将pNapB和pFAE1两个启动子分别与报告基因GUS融合并通过农杆菌介导法导入烟草,得到大量转基因烟草植株。对T1代转基因烟草进行组织化学分析,比较了不同启动子的组织表达特异性。结果表明,两种启动子都只在种子中起作用,属于典型的种子特异性表达启动子,但是它们作用的时间和空间分布以及作用强度明显不同。pNapB启动子比pFAE1作用开始的时间早,持续时间长,在早期作用比pFAE1强,但pFAE1启动子在种子发育中期启动速度快,成熟种子的GUS染色深度在两种启动子间差别不大。     

甜瓜ACC氧化酶前导激应元件的克隆与序列分析

以甜瓜基因组ＤＮＡ为模板,利用ＰＣＲ技术扩增获得甜瓜ＡＣＣ氧化酶基因家族成员ＣＭ－ＡＣＯ１的前导顺式元件,长度为 ８８６ｂｐ。将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体上。序列分析结果表明：克隆的 ＣＭ－ＡＣＯ１基因顺式元件的核苷酸序列与已报道的相比有９９．６％同源,元件中含ＢＲＥ,ＥＲＥ,ＷＵＮ等,能接受多种外界信号刺激。      

甘蓝型油菜胚胎特异启动子pBnaA09g21960D的分析

为筛选甘蓝型油菜胚胎特异性表达启动子,以甘蓝型油菜冬性品种Darmor的叶片基因组为模板,克隆了Bna A09g21960D基因上游990bp的启动子序列。顺式调控元件的预测分析表明,该启动子除具有核心调控元件TATA box和CAAT-box外,还含多个组织特异性、激素、逆境、光合作用等表达相关的顺式作用元件,如ABRE、GCN4_motif、TGACG-motif等。为了验证该基因启动子的表达模式,构建了由其驱动GUS报告基因的植物融合表达载体DX2181-p Bna A09g21960D,并采用农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥。对筛选和鉴定的阳性转基因株系进行GUS组织化学法染色,结果表明GUS活性在拟南芥胚胎中特异表达,而在其他组织和器官均未表达,这表明p Bna A09g21960D具有驱动GUS报告基因在拟南芥种子胚胎中特异表达的潜质。这为该启动子在转基因技术提高油菜品质方面和人工创建种质资源等方面的应用提供了较好的基础。     

抗真菌蛋白Rs—AFPs基因克隆与序列分析

从开花后５０－９０ｄ的萝卜种子中提取总ＲＮＡ,逆转录合成ｃＤＮＡ第一链,通过ＰＣＲ反应,得到Ｒｓ－ＡＦＰ１和Ｒｓ－ＡＦＰ２基因扩增产物。采用Ｔ－载体克隆技术,将二分别插入ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＥｃｏＲＶ－Ｔ克隆载体,得到重组质粒ｐＧＲ－１和ｐＧＲ－２用其转化宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α,从阳性菌落制备测序用质粒ＤＮＡ样品,在ＡＢ１３７０Ａ ＤＮＡ测序仪上测序。     

玉米醇溶蛋白ze19基因启动子克隆与功能分析

从玉米自交系9801基因组DNA中克隆玉米醇溶蛋白基因ze19启动子,将其克隆到pMD18-T载体上.该序列与发表序列同源性为94％,包括TATA box、CAAT box启动子基本元件以及多种参与调节醇溶蛋白表达的顺式元件.将ze19启动子取代质粒PBI 121-gus中的CaMV35S启动子,构建由ze19启动子驱动GUS的植物表达载体pBIze19-gus,利用土壤杆菌介导法将重组载体pBIze19-gus转入烟草中.对转基因烟草植株GUS活性的定性与定量分析结果表明,ze19启动子驱动GUS基因在转基因烟草种子中表达活性最高,在叶片中活性很弱,在茎中没有活性.所克隆的ze19启动子具有种子特异表达特性,为玉米种子生物反应器的研究提供借鉴.     

大豆组织特异启动子的克隆与功能分析

采用同源序列法克隆得到了大豆根部特异性启动子、种皮特异性启动子、种子特异性启动子,核苷酸序列大小分别为2 500bp、1 832bp、1 268bp,分别具有CANNTG-motifs、GATA-box、ACGT等启动子表达元件,并分别构建了这3个组织特异性启动子的植物报告表达载体。通过农杆菌介导法将3个表达载体转入烟草NC89,通过组织化学染色和GUS基因的相对表达量分析验证3个启动子的功能。通过转化获得了根部特异性启动子转基因烟草植株11株,种皮特异性启动子转基因烟草植株4株,种子特异性启动子转基因烟草植株8株,转35S启动子启动GUS基因的阳性烟草植株7株。GUS化学组织染色结果表明,克隆得到的根、种皮、种子特异性启动子都表现为组织特异性表达,表达水平明显高于叶片、茎部、花等部位。进一步的荧光定量PCR结果显示,根部特异性启动子GUS的相对表达量在根部最高,而在茎、叶、种子、种皮、花中表达量较低;种皮部特异性启动子GUS的相对表达量在种皮最高,而在根、茎、叶、种子、花中表达量较低;种子特异性启动子GUS的相对表达量在种子最高,而在根、茎、叶、种皮、花中表达量较低,但是与35S启动子相比,这3个特异性启动子的GUS相对表达量在相应的组织均低于35S启动子。     

大豆种子尿素溶液拌种育肥技术

大豆种子尿素溶液拌种育肥技术张晓，夏剑伶，袁北林，王永波，车风占（黑龙江省八五四农场）ＴＨＥＥＸＵＢＥＲＡＮＬＥＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＯＦＭＩＸＩＮＧＴＨＥＳＯＹＢＥＡＮＳＥＥＤＳＷＩＴＨＵＲＥＡＬＩＱＵＩＤ￥ＺｈａｎｇＸｉａｏ；ＸｉａＪｉａｎｌｉｎｇ...     

花生条纹病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用内切酶Ｂａｍ ＨＩ和ＥｃｏＲＩ将ｐＧＥＭ－ ＳｔＶ 含有的约１１Ｋｂ 大小的ＰＳｔＶ－ ｃｐ 基因切下定向插入到表达质粒ｐＢＶ２２０ 的启动子ＰＲ、ＰＬ的下游,构建了该基因的原核表达载体ｐＢＶ－ ＳｔＶ。ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ凝胶电泳结果表明：ＰＳｔＶ－ ｃｐ 基因在大肠杆菌ＤＨ５α中经温度（４０℃）诱导后,可特异地表达３３ｋＤ蛋白。     

陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列分析

为了筛选棉花抗逆转基因育种的候选启动子,根据陆地棉脱水素基因GhDHN1的cDNA序列和陆地棉基因组序列,利用生物信息学分析方法,获得棉花陆地棉脱水素基因GhDHN1启动子序列。结果表明,该启动子上多个位点含有启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,并含有非生物逆境胁迫响应元件、响应植物激素顺式作用元件、多种光调控相关的顺式作用元件以及胚乳表达顺式调控元件等。推测GhDHN1基因的启动子受光诱导,同时受低温和干旱胁迫等非生物逆境的诱导,参与棉花的生长发育。     

巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因5＇调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066 bp的5＇调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39 %,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植     

巴西橡胶树HbWRKY1基因5′调控序列的克隆及功能初步鉴定

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY1基因的表达调控机制,采用染色体步移法克隆了HbWRKY1基因的5′调控区序列。结果表明,该序列具有预测的核心启动子区域位于-6~-57 bp,转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处;该序列具有TATA-box,CAAT-box和GATA-box等多个典型的真核生物启动子基本的顺式作用元件,同时还具有低温响应元件LTR,赤霉素反应元件GARE-motif,生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,此外还有与MYB结合的MBS元件,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件。构建了不同长度的HbWRKY1启动子片段的植物表达载体并转化本生烟草, 通过潮霉素抗性和PCR鉴定,获得了转基因植株。对获得的转HbWRKY1不同长度启动子片段的转基因T1植株GUS染色发现,植株的茎、叶柄、主叶脉和根中均可呈现蓝色,表明HbWRKY1基因的5′调控区可以启动GUS基因的表达, 具有启动子的活性。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

为深入研究巴西橡胶树HbWRKY1基因的表达调控机制,采用染色体步移法克隆了HbWRKY1基因的5'调控区序列.结果表明,该序列具有预测的核心启动子区域位于-6～-57 bp,转录起始位点位于翻译起始位点上游41 bp处;该序列具有TATA-box,CAAT-box和GATA-box等多个典型的真核生物启动子基本的顺式作用元件,同时还具有低温响应元件LTR,赤霉素反应元件GARE-motif’生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,此外还有与MYB结合的MBS元件,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件.构建了不同长度的HbWRKY1启动子片段的植物表达载体并转化本生烟草,通过潮霉素抗性和PCR鉴定,获得了转基因植株.对获得的转HbWRKY1不同长度启动子片段的转基因T1植株GUS染色发现,植株的茎、叶柄、主叶脉和根中均可呈现蓝色,表明HbWRKY1基因的5'调控区可以启动GUS基因的表达,具有启动子的活性.     

大豆种子特异性启动子研究进展

种子中的营养成分是植物基因工程改良的重要目标,种子特异性启动子能够调控外源基因在种子中专一性表达,利用高效特异性强的种子特异性启动子可以按照人们的意愿改进及提高种子中营养物质含量。因此,明确大豆中种子特异启动子的调控机制及获得更多大豆种子特异性启动子对大豆改良研究及应用具有巨大的推动作用,该文综述了种子特异性启动子顺式作用元件、相关转录因子的特点及大豆中种子特异性启动子在植物基因工程中研究应用的最新进展。     

大豆F-box基因Glyma08g11030启动子克隆及植物表达载体构建

本研究以大豆Williams 82的基因组DNA为原始材料,根据前期预测的Glyma08g11030启动子序列用DNAMAN8.0设计引物,通过常规PCR方法克隆获得了Glyma08g11030基因上游长度为3 000 bp的启动子序列。在PlantCARE植物启动子区域在线预测网站上查询,预测的结果显示Glyma08g11030启动子序列里含有数量众多、功能各异的顺式作用元件。其中以TATA-box和CAAT-box这两个基本的顺式作用元件最多,此外还有许多与应答相关的顺式作用元件,如干旱、热、光、激素等。根据这些顺式作用元件在Glyma08g11030启动子序列中的位置对启动子序列进行截短并分别设计引物,采用PCR方法成功截出了3段长度分别为2 492,1 185和342bp的启动子序列,将3段序列替换pCAMBIA3301载体双酶切出的CaMV35S启动子序列,并构建了3个启动子序列驱动GUS植物融合表达载体,从而得到含不同顺式作用元件的启动子序列。研究结果将为以后分析Glyma08g11030启动子的功能和作用机理提供前期准备。     

烟草Ⅰ类几丁质酶和β—1,3—葡聚糖酶cDNA植物双价表达载体的构？…

将烟草中经修饰的Ⅰ类几丁质酶和β－１,３－葡聚糖酶ｃＤＮＡ分别加上ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和ＮＯＳ终止子,依次插入到同一植物表达载体ｐＢｉｎ１９上,获得植物双价表达载体ｐＣＧ－Ⅱ。     

陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的启动子序列分析

为了筛选棉花耐盐转基因育种所需的诱导型候选启动子，本研究根据陆地棉焦磷酸酶基因GhVP的cDNA序列和陆地棉基因组序列，获得陆地棉焦磷酸酶基因GhVP启动子序列，并对其进行生物信息学分析。结果表明，该启动子具有多个基本元件TATA-box和CAAT-box，并含有多种逆境胁迫诱导相关的响应元件，含有丰富的光响应元件以及其他多种顺式作用元件。推测GhVP基因的转录同时受光、高温、干旱、创伤、脱落酸诱导，受生物钟控制的顺式元件调控，参与棉花的生长发育。     

茶树N-甲基转移酶基因启动子克隆及功能分析

咖啡碱是茶叶中重要的功能物质,N-甲基转移酶（NMT）是其生物合成的关键酶。本研究以英红9号茶树新梢为材料,利用hiTAIL-PCR克隆NMT1基因启动子,并采用Plant CARE等在线软件分析其顺式作用元件。根据其元件组成,设计5'递减的启动子与GUS基因一起组建了融合载体转入烟草,利用GUS染色和定量PCR方法,分析了克隆的启动子功能及其对环境因子的响应。结果表明,克隆的NMT1基因启动子长767βbp,含有TATA-box、CAAT-box等真核生物启动子基本元件及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件。以5'递减的NMT1启动子替换pBI121中的CaMV35S启动子,构建出与GUS融合的pA、pB、pC、pD载体。在烟草叶片中进行瞬时表达,不同长度的NMT1启动子均具驱动GUS表达功能,且长度越长驱动能力越强。以含全长NMT1启动子载体pA对烟草转基因,转基因烟草各组织均检测到GUS基因的表达且表达量叶>茎>根,叶片中的表达量为根部的3倍。对转基因烟草进行不同程度光照、温度、模拟干旱和脱落酸处理后,除40℃温度条件外,其他处理的叶片中GUS基因表达在处理前后均存在显著变化,表明NMT1启动子功能受外界环境因子的胁迫影响。     

水稻二化螟诱导表达基因OsSABATH启动子的克隆与缺失体构建

Northern杂交结果表明,OsSABATH基因受二化螟(Chilo suppressalis)为害诱导表达,但却不受机械损伤诱导。利用该基因序列和水稻基因组数据库相应序列设计引物,扩增到该基因编码区5′上游2050 bp的启动子序列。用PLACE软件分析顺式作用元件,发现该基因起始密码子上游1.4 kb的区域内存在几个可能与该基因表达调控相关的顺式作用元件,如W盒、DOF 结合序列、GT 1、 BIHD1 结合序列等。将该基因启动子区域及其5′部分缺失构件与GUS报告基因相连,并克隆进pCAMBIA1391载体中,用于分析启动子活性及虫伤诱导特异性相关的顺式作用元件。     

白木香愈创木烯合酶基因(AsSGS)启动子的克隆及功能初步鉴定

利用染色体步移的方法克隆了一种白木香倍半萜合酶——愈创木烯合酶基因(AsSGS)791 bp的启动子序列,序列分析表明,获得的序列中A/T含量达64.6%,与真核生物启动子序列的特征相符合。该序列除具有启动子核心序列TATA-box和增强子元件CAAT-box等典型的真核生物启动子基本元件外,还含有如赤霉素反应元件GARE-motif、ABA的应答元件G-Box、生长素响应元件TGA-element和脱落酸响应元件ABRE等参与激素调控元件,光应答元件Box I、GA-motif、TCT-motif,热胁迫反应的HSE,厌氧诱导元件ARE和增强诱发厌氧反应的GC-motif等顺式作用元件。利用农杆菌介导的本生烟草瞬时表达系统对所获得的启动子功能进行鉴定,结果表明,所有缺失片段都能驱动β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因表达,GUS活性与启动子片段的长度呈正相关。