菜豆几丁质酶基因Bchi的克隆及其在转基因烟草中的表达

本文根据GenBank中公布的菜豆几丁质酶基因cDNA序列设计引物,通过RT-PCR得到一个菜豆几丁质酶基因家族基因Bchi.该基因编码一个327个氨基酸的多肽,其结构包括信号肽、几丁质结合区、铰链区、催化区和液泡定位多肽,属于Class Ia类内切几丁质酶.构建该基因的植物表达载体pMHL7133-Bchi,并通过发根农杆菌R1000介导转化烟草,经PCR和Southern blot鉴定获得了4株转基因烟草株系.几丁质酶活性分析表明,转基因烟草几丁质酶活力明显高于对照.抗真菌实验结果显示,转基因烟草的叶片基本无病斑产生,表明Bchi基因在烟草中高水平的表达显著提高了烟草对真菌病害的抗性.     

维管特异启动子BSP驱动的基因Chi、Glu双价载体构建

几丁质和β-1,3-葡聚糖是绝大多数真菌细胞壁的主要成份,可分别被几丁质酶(Chitinase,Chi)和β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,Glu)降解,而且它们具有协同抗真菌的作用,几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶存在于大多数植物细胞中。在正常情况下,植物体内的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶只有低水平的组成型表达,但在病原菌侵染、诱导物刺激及各种伤害下可诱导产生大量的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。而真菌病害是危害植物的主要病害之一,这些病害主要通过韧皮部运输而进一步扩展到其他部位。如果利用维管特异表达启动子调节目的基因在韧皮部高效特异地表达,就可以更为有效地发挥目的基因的作用。为此,克隆了维管特异BSP启动子和Chi、Glu基因,并构建了以BSP驱动的Chi和Glu基因的双价表达载体pBIBCG。重组质粒pBIBCG经过PCR分析鉴定,结果表明,以维管特异启动子BSP驱动的含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功,为植物抗真菌基因工程育种奠定了基础,对提高植物的整体抗病性具有重要的作用。     

木薯Ⅴ型几丁质酶MeCHITVb基因克隆及其表达载体构建

几丁质酶在生物逆境环境和非生物逆境环境中发挥着重要作用.为研究木薯几丁质酶在响应低温胁迫下的分子作用机制,利用RT-PCR技术,从木薯耐低温品种SC124中克隆到CHITVb基因,利用平末端连接技术构建pEASY-MeCHITVb克隆载体,用于测序确定目标基因序列,并对其序列进行分析,构建植物表达载体.结果 表明,成功克隆木薯CHITVb基因,命名为MeCHITVb.通过生物信息学分析,该基因全长1050 bp,编码349个氨基酸,理论相对分子量为38.08 kD,理论等电点为4.53,是一种稳定蛋白.经序列比对和系统进化树分析表明,MeCHITVb基因与烟草、拟南芥V型几丁质酶基因亲缘关系最近.用pEASY-MeCHITVb与植物表达载体pISV2678构建重组子pISV-MeCHITVb,利用"Golden Gate"克隆方法构建基因编辑载体CRISPR/Cas9-MeCHITVb.将植物过表达的pISV-MeCHITVb和CRISPR/Cas9-MeCHITVb载体成功转化为根状杆菌LBA4404.本研究为后续MeCHITVb基因功能研究、木薯抗寒、抗病品种的选育及木薯北移栽培提供理论依据.     

几丁质酶基因克隆及其野生蕉转化

本研究根据GenBank公布的木霉几丁质酶基因(chitinase)序列设计一对引物,采用RT-PCR方法从木霉(Trichoderma spp.)中克隆获得了几丁质酶基因全序列,编码区共1275bp,推测其编码424个氨基酸,该基因与哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的内切几丁质酶基因chit42(GenBank accession No.L14614)具有99%的同源性。在此基础上,将获得的几丁质酶基因从pGEM-T载体中用XbaⅠ和BamHⅠ切下,克隆到pBI121植物表达载体的XbaⅠ和BamHⅠ位点,构建了植物表达载体pBI-chit并将其转入根癌农杆菌菌株EHA105。该菌株转化野生蕉(Musa itinerans Cheesm.)胚性细胞悬浮系,经过抗性筛选、胚的诱导和萌发,获得成熟体细胞胚和再生苗。通过GUS组织化学法检测和PCR方法鉴定,结果表明外源基因已经成功转入到野生蕉中。本研究为下一阶段转化香蕉栽培品种和筛选抗香蕉枯萎病新种质奠定一定的基础。     

木霉双价基因表达载体的构建

利用几丁质酶基因和β-1,4-葡聚糖酶基因构建双价基因表达载体,为木霉转化奠定基础。利用限制性内切酶酶切得到目的基因片段,通过T4 DNA ligase将基因插入表达框中,并采用PCR、酶切和核苷酸序列分析验证双价基因表达载体的正确性。利用启动子CaMV35S和终止子PolyA构建几丁质酶基因chi42的表达框,获得表达载体pC1302-C42;利用启动子CaMV35S和终止子Nos构建β-1,4-葡聚糖酶基因glu14的表达框,获得表达载体pC1300-2-G14;在单基因表达载体的基础上,通过串联构建双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42,该表达载体含有潮霉素B抗性基因。经检测证实表达元件35S-chi42- PolyA和35S-glu14-Nos连接成功。得到的双价基因表达载体pC1300-2-G14-C42可直接用于木霉等丝状真菌的遗传转化,为构建木霉广谱高效工程菌株奠定基础。     

花生抗黄曲霉的植物双价表达载体的构建

通过常规育种培育的抗黄曲霉品种皆表现抗性不稳定,鉴此开展通过基因工程手段以培育高抗以及无筛选标记的转基因花生品种。几丁质酶基因CHI和葡聚糖酶基因GLU皆为广谱性的抗病基因且具有协同增效作用。分别以pSC1300-8-CHI和pSC1300-13-GLU载体为基础,通过PCR技术在CHI基因的特异启动子8#前端和T-nos末端分别加入NcoⅠ酶切位点和AflⅡ酶切位点,在GLU基因的特异启动子13#前端和T-nos末端分别加入ApaⅠ酶切位点和SpeⅠ酶切位点,通过酶切、连接将上述2个基因连接在抗生素自我删除载体pLoxp上,获得了具有抗生素自我删除选择标记的双价果种皮特异表达载体pLoxp-8-CHI-13-GLU。经过限制性内切酶鉴定,该植物表达载体构建成功。     

pCB-zeolin-GFP表达载体的构建及瞬时表达

为利用荧光蛋白基因GFP检测外源基因在转基因植株中的表达和定位,构建含有GFP基因的植物表达载体pCB-zeolin-GFP。在目的基因的开放阅读框（ORF）两端设计引物,并引入酶切位点和保护碱基,用PCR方法从pDHA扩增得到zeolin基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302植物表达载体,经回收、连接、转化、鉴定后,利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞,通过共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。构建了zeolin基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的植物表达载体pCB-zeolin-GFP,并在洋葱中得到了表达。构建的融合植物表达载体pCB-zeolin-GFP正确,该载体的成功构建为今后进行基因转移、基因功能研究及培育新品种奠定了基础。     

转Lchi1烟草T_2代对梨腐烂病菌的抗性研究

获得转化梨几丁质酶基因Lchi1的烟草,检测组成型表达Lchi1基因烟草是否能提高对梨腐烂病菌(Valsa ceratosperma)的抗性,从而初步确定Lchi1基因的功能,为进一步开展梨抗腐烂病分子育种工作提供参考。构建梨几丁质酶基因Lchi1的植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,进而对转化的烟草T2代进行PCR及RT-PCR检测。利用离体叶片接种法,更直观地验证转基因烟草对梨腐烂病菌的抗性。Lchi1基因已经整合到烟草基因组中,并在烟草T2代中有效表达,在接种腐烂病菌后转基因烟草较未转基因烟草的抗腐烂病菌能力明显增强。梨几丁质酶基因Lchi1与腐烂病抗性相关联,可作为今后梨的抗腐烂病分子育种研究重要的基因来源。     

草莓乙烯受体FaEtr2基因植物表达载体构建

为通过转基因技术改善草莓的贮运性能,以全明星草莓为试材,克隆了与草莓成熟有关的FaEtr2基因的2个片段,并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体FaEtr2基因序列及表达载体pBI221上的酶切位点设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个全明星草莓FaEtr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体pBI221的35 S启动子和NOS终止子之间,分别构建成All Star-FaEtr2基因的正、反义植物表达载体。     

棘孢木霉几丁质酶基因的原核表达、复性、纯化以及酶学性质研究

为高效表达几丁质酶基因tachi1,研究Tachi1的酶学性质。采用PCR技术从棘孢木霉中克隆了几丁质酶基因tachi1并与pEHisTEV原核表达载体融合,转化大肠杆菌BL21。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得了以包涵体形式高效表达的Tachi1。包涵体经洗涤、溶解、复性和纯化后获得了高纯度的Tachi1。复性后的Tachi1具有较高的几丁质酶活性,该几丁质酶反应的最适温度为50℃,最适pH 5.5。几丁质酶在30~35℃下稳定,在pH 3~7之间几丁质酶有较高活性。     

可去除选择标记的转Bt基因抗虫玉米研究

将组成型表达的玉米泛素启动子与苏云金杆菌杀虫蛋白基因Bt连接，插入根瘤农杆菌双T-DNA质粒，构建一个T-DNA结构域含有抗潮霉素选择标记基因hyg，另一个T-DNA结构域含有抗虫基因的双T-DNA单子叶植物表达载体，用以转化农杆菌菌株，再通过共培养转化玉米胚性愈伤组织。通过潮霉素培养基抗性筛选，用特异PCR扩增和Southern杂交检测，从分化再生的T0代植株中，鉴定出4个转化Bt基因的阳性植株。目前，正结合进行田间分离纯合和DNA分子鉴定，培育去除选择标记基因的转基因抗虫玉米自交系。     

家蚕抗菌肽attacin基因植物表达载体的构建

抗菌肽是昆虫抵御外界微生物侵染的主要物质。本文利用双酶切将pBI121载体上的植物启动子CaMV35S克隆到植物表达载体pCAMBIA2300上,构建重组表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S。PCR扩增家蚕抗菌肽attacin基因编码区全长并利用T载体成功克隆（GenBank登陆号：GU244351）,然后利用双酶切将attacin 基因亚克隆到pCAMBIA2300-CaMV35S上,通过PCR鉴定,成功构建了attacin基因的植物表达载体pCAMBIA2300-CaMV35S-attacin。为研究attacin基因在植物抗病性方面的应用奠定基础。     

PRRS病毒E基因的克隆及表达载体的构建

分别以质粒pBV221和pPIC9K为表达载体,成功构建了PRRS病毒E基因克隆载体,转化后经抗性筛选、PCR扩增、双酶切鉴定,确认得到了含有目的基因的阳性克隆。对含有E蛋白原核表达载体的阳性克隆进行诱导表达,经过酶联免疫鉴定,结果显示外源蛋白在宿主菌中有表达,成功实现了在大肠杆菌细胞中的克隆。本研究成功构建了PRRSV BJ-4毒株E基因的原核表达载体和真核表达载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

长白猪甘露聚糖结合凝集素A基因的 克隆与原核表达

从长白猪肝脏细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增pMBL-A基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,得到猪甘露聚糖结合凝集素A（porcine mannan-binding lectin A,pMBL-A）基因。再亚克隆到pPROEXHTb表达载体上,构建重组表达质粒。将阳性重组表达质粒转化到大肠杆菌中诱导表达重组pMBL-A蛋白,通过SDS-PAGE检测蛋白的表达情况。结果成功扩增得到包括完整开放读码框长为875bp的全长cDNA片段,并原核表达了重组蛋白,为进一步研究该蛋白的遗传特征以及为猪遗传育种方面的研究提供依据。     

玉米ZmCKX基因的克隆及分析

细胞分裂素氧化酶降解细胞分裂素,从而调控植物的生长发育,克隆和分析玉米细胞分裂素氧化酶基因(ZmCKX),为研究ZmCKX在玉米抗逆反应中的作用奠定基础。运用RT-PCR和RACE技术克隆了ZmCKX基因的cDNA全长,并对其进行了初步的生物信息学分析。琼脂糖凝胶电泳鉴定结果表明,PCR扩增出一条约1035bp的片段,与目的片段大小相似。将目的片段与pMD-19t构建的pMDZmCKX重组质粒并转化为DH5α,经检测片段与原始片段大小相同。Blastn分析结果表明,其与ZmCKX1的相似性为99%。对该基因序列分析表明,ZmCKX基因编码的蛋白的开放阅读框为1035bp,起始位点为23bp,终止位点为1057bp。ZmCKX基因长1035bp,编码344个氨基酸。它与ZmCKX1基因核苷酸同源性99%。ZmCKX基因编码的蛋白是存在于细胞质中的亲水蛋白。     

棉花(Gossypium hirsutum)ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及鉴定

ROP是高等植物里一类分布广泛的信号小G蛋白,在植物生长、发育、抗逆、抗病和激素信号转导过程中起重要调控作用。本研究用PCR体外扩增技术获得棉花GhROP1基因片段,将目的基因与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组,构建诱饵质粒pGBKT7-GhROP1,并成功的转入到Y187酵母菌通过缺陷性培养基培养进行毒性和自激活检测。结果表明,成功克隆棉花GhROP1基因,该基因开放阅读框共有591 bp。双杂交诱饵表达载体pGBKT7-GhROP1构建成功,并成功转化酵母菌Y187;结果显示含表达载体的酵母菌Y187在SD/-Trp平板上长势良好,说明表达蛋白对酵母菌无毒害作用。在SD/-Leu,SD/-Trp-Leu,SD/-Trp-Leu-His-Ade平板上则没有生长,说明转化pGBKT7-GhROP1质粒后的Y187酵母菌无自激活发生。本研究结果为下一步利用酵母杂交系统筛选GhROP1蛋白相互作用的蛋白提供理论参考。     

鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶的原核表达

为了原核表达鸭疫里默氏菌噬菌体RAP44的裂解酶基因,以噬菌体RAP44的基因组为模板,用PCR方法扩增裂解酶基因,与表达载体p GEX-6P-1连接,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)中表达,利用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和柱纯化表达蛋白。结果成功构建了表达载体p GEX-N,转化菌经IPTG诱导后成功表达出了分子量约为37 k D的可溶性重组蛋白。本研究获得了纯化的鸭疫里默氏菌噬菌体裂解酶重组蛋白,为裂解酶的功能研究奠定了基础。     

O型口蹄疫病毒VP1蛋白的原核表达及功能鉴定

为获得具有免疫原性的FMDV VP1蛋白,以O型FMDV重组质粒PMD18T-VP1为模板,利用PCR技术扩增得到O型FMDV VP1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET32a连接,构建重组表达载体,命名为pET-VP1,经PCR和测序鉴定后,用IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western-Blot分析.结果显示,在分子量约为45 ku处有1条明显的蛋白条带,且能被口蹄疫阳性血清识别,表达产物通过包涵体纯化后用透析法复性;ELISA检测结果显示,所复性的蛋白具有较高的活性.结果表明,FMDV VP1蛋白在大肠杆菌中得到高效表达,为开发诊断制剂和疫苗的研制打下基础.     

大豆GmMYB12B2植物表达载体的构建及转化烟草

为研究大豆MYB转录因子-GmMYB12B2在转基因植物类黄酮代谢中的作用,利用吉林大学植物种质资源与利用研究室前期克隆的GmMYB12B2基因,以PPZP质粒为表达载体,构建了由组成型CaMV35S启动子驱动GmMYB12B2基因的植物表达载体PPZP-GmMYB12B2;然后,采用冻融法转入农杆菌EHA105菌株,通过叶盘法对烟草进行遗传转化。经PCR随机扩增鉴定9株转基因烟草,其中有6株是阳性植株,初步证明已获得转大豆GmMYB12B2基因的烟草。