杉木叶片原生质体分离及RNA提取体系的建立

【目的】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分析不同因素对杉木原生质体分离的影响,建立杉木叶片原生质体分离体系,以期为杉木基因功能验证提供有效的技术平台;比较不同RNA提取方法,筛选获得杉木原生质体总RNA提取的有效方法,为今后利用杉木原生质体开展分子生物学研究提供技术支持,也可为其他林木原生质体的总RNA提取研究提供参考。【方法】选取杉木组培苗最上端未分轮的幼嫩叶片为材料,通过分析5种不同酶组合、真空处理时间(0、5、10、15、20 min)、渗透压(0.3、0.4、0.5、0.6 mol·L-1甘露醇)、BSA浓度(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)及酶解时间(1、2、3、4、5 h)5个条件,进行杉木叶片原生质体的分离。采用改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、CTAB-Li Cl法、CTAB-Li Cl+10μg糖原法、改良CTAB-异丙醇法、改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法、天根RNA提取试剂盒法共7种方法提取杉木原生质体RNA,通过杉木内参基因和2个特异基因进行RNA质量验证,比较不同方法的提取效果。【结果】在1.5%纤维素酶R-10、1%离析酶R-10、0.2%果胶酶Y-23、0.5 mol·L-1甘露醇以及0.3%BSA的混合酶液中,真空处理10 min,酶解2 h,可分离出高活力的纯净杉木原生质体,其产量可达到7.27×106个·g-1,活力可达到94%。7种方法皆能提取出杉木叶片原生质体的总RNA,但不同方法间存在明显差异,其中改良Trizol法、改良Trizol+10μg糖原法、改良CTAB-Li Cl法、改良CTAB-Li Cl+10μg糖原法提取的RNA有不同程度的降解现象,其余方法所提取的RNA完整性较好,且OD260/280和OD260/230值均在1.8~2.0范围内;在RNA得率方面,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg,分别是改良CTAB-异丙醇法和天根RNA提取试剂盒法的1.73倍和1.58倍;综合考虑,改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法提取杉木原生质体RNA的效果最好。【结论】以杉木组培苗幼嫩叶片为材料,分离条件为纤维素酶R-10浓度1.5%、离析酶R-10浓度1%、果胶酶Y-23浓度0.2%、甘露醇浓度0.5 mol·L-1、BSA浓度0.3%,真空处理10 min,酶解2 h,可大量获得高质量的杉木原生质体;利用改良CTAB-异丙醇+10μg糖原法,可高效提取杉木原生质体RNA,106个细胞RNA产量平均可达到6.89μg。研究结果为杉木重要性状关键基因的功能研究及其在育种中的应用提供了重要基础。     

人心果原生质体分离初探

以人心果幼嫩叶片组织为材料,研究了酶液组合、酶解时间、酶液中甘露醇含量、pH值、温度等因素对其原生质体分离的影响,结果表明:以3%纤维素酶R-10+0.4%果胶酶Y-23为混合酶液,0.6 mol.L-1甘露醇为渗透压稳定剂,pH 5.6的酶液组合,在28℃的黑暗条件下振荡,酶解时间2 h,分离出的原生质体产量最佳,可达到12.4×106个.g-1。     

银杏原生质体制备及其融合研究

以银杏品种湖南梅核成熟胚进行组织培养得到的无菌苗和愈伤组织为材料,用不同酶液处理进行原生质体制备,并用PEG法进行原生质体融合实验。结果显示,以2.0%纤维素酶+1.0%果胶酶+5.0mmol/LMES+6mmol/LCacl2+0.6mol/L甘露醇( 号酶液)酶解银杏组织、方法1提取原生质体效果最好,其最高原生质体产率为9.4×107个/g;以17%蔗糖溶液处理得到原生质体质量最好。用40%PEG6000+0.3mol/L钙离子+pH9.5液体处理原生质混合液,银杏原生质体融合率最高,为67%。     

转不同抗虫基因741杨的抗虫选择性

以转抗虫基因(BtCry3A)741杨7个株系和转双抗虫基因(BtCrylAc API)741杨2个株系为材料,从分子生物学检测、毒蛋白的表达、抗虫性检测3个方面,研究转不同Bt基因741杨对不同类型害虫的抗虫选择性.结果表明:2种Bt抗虫基因分别在转基因741杨不同株系中稳定存在.转BtCrylAc的2个株系毒蛋白含量分别为0.012 7%和0.009 9%,具高抗虫性的株系pb29的毒蛋白含量高于中等抗虫性的株系pb17.转BtCry3A基因的5个株系毒蛋白含量为0.067 8%～0.152 1%,不同株系间存在一定差异.BtCry3型的毒蛋白表达量非常高,是BtCry1型的10倍.用对鳞翅目害虫具高抗虫性和中等抗虫性的转双抗虫基因(BtCrylAc API)741杨株系叶片饲养鞘翅目害虫柳蓝叶甲,幼虫死亡率达到28.4%～42.8%,转基因株系与未转基因的对照没有明显差异.用转BtCry3A基因741杨不同株系叶片饲养柳兰叶甲幼虫,均表现出高抗虫性,死亡率在2天之内均可达到100%;而饲养杨扇舟蛾幼虫,死亡率为0～42.86%,未表现出明显抗虫性,与未转基因对照没有明显差异.     

山地杨MD-110原生质体的分离技术

山地杨MD-110(P.maximowiczii×P.deltoides)是黑杨派与青杨派的优良杂交品种.选择生长约1个月无菌苗的健壮叶片(长1.5～2 cm),切成长约0.5 mm的细条,在2%纤维素酶RS、0.05%果胶酶Y-23、0.6 M甘露醇(pH=5.6)组成的酶液进行分离,分离出大量的具有活力的原生质体,且大小均匀,细胞膜完整;酶解2 h后轻轻摇动培养皿利于酶解,酶解时间以6 h为宜.纯化后其原生质体的产量为3.6×107/gfr.wt,活力可达90%以上.纯化后的原生质体在B5(2倍浓度)培养基,附加2,4-D 10 nag·L-1、NAA 0.2 mg·L-1和BAP 1 mg·L-1中进行高密度液体浅层培养.     

狭叶薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离研究

探究薰衣草愈伤组织诱导及原生质体分离的最适条件,为薰衣草品种优化和育种工作提供基础数据和理论依据。以薰衣草幼嫩叶片为原材料,采用化学诱导方法诱导薰衣草脱分化形成愈伤组织,利用酶解法促使原生质体游离;结合染色排除法计算原生质体活力。实验结果表明,当MS培养基中加入2,4-D(1.8mg/L)和6-BA(0.5mg/L)时,薰衣草的出愈率最高,可达88%;愈伤组织在纤维素酶和果胶酶的含量分别为1.8%、0.5%的条件下,酶解原生质体的产量最高,可达1.180×10~5个/g,原生质体活力最高,可达78.05%。本实验获得的高效愈伤组织诱导条件,为后续愈伤组织再生体系研究提供资料支持。建立了原生质体分离体系,稳定的获得了高产量、高活力的原生质体。     

地锦与五叶地锦原生质体分离及培养研究

用纤维素酶、果胶酶、甘露醇的混合酶液提取地锦和五叶地锦无菌苗幼叶、五叶地锦胚乳愈伤组织及地锦幼胚愈伤组织的原生质体,对影响原生质体提取得率及活力因素进行分析,对不同材料原生质体得率进行比较,对提取的原生质体进行液体浅层、固液结合及固体等方式培养,对原生质体形成的愈伤组织以MS和改良B5培养基附加不同浓度NAA、6-BA、2,4-D、PEG、KT、ZT等进行分化培养.试验结果表明纤维素酶对原生质体提取得率有极显著影响,适宜地锦幼叶原生质体提取的酶液组合为纤维素酶O.5%、果胶酶0.3%、甘露醇0.6 mol·L-1、酶解8 h;不同材料原生质体提取得率有显著差异;仅五叶地锦胚乳愈伤组织来源的原生质体在固体培养基中形成新的愈伤组织,其它方式培养的不同材料原生质体均无分裂或仅形成数十个细胞的细胞团后便解体;用30余组配方进行了五叶地锦胚乳愈伤组织原生质体形成的新愈伤组织的分化培养,继代6～10次后仍无分化迹象.     

不同酶解条件对金边瑞香幼叶原生质体分离的影响

以室内培养的金边瑞香浅黄绿色、质地幼嫩的叶片为材料,探讨了影响其原生质分离的因素。结果表明:对原生质分离效果影响最大的是纤维素酶浓度和酶解时间;采用纤维素酶质量分数为0.2%、甘露醇质量浓度为0.6 mol.L-1、酶解时间为10 h时原生质分离效果最好,原生质体的产量为2.2×105个.g-1。     

黄竹细胞悬浮培养和原生质体分离*

以牡竹属黄竹（ＤｅｎｄｒｏｃａｌａｍｕｓｍｅｍｂｒａｎｃｅｕｓＭｕｎｒｏ）的竹节及无菌苗根颈为外植体，培养于含有５ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ、０．２ｍｇ／ＬＫＴ和２００ｍｇ／ＬＬＨ的ＭＳ培养基上诱导愈伤组织，然后移至相同成份或不同浓度２，４－Ｄ的液体培养基中，进行悬浮培养，以建立分散性良好的悬浮细胞系。利用悬浮细胞和无菌苗叶片经酶解获大量原生质体，其产量分别约为每克鲜重２．５×１０５个和５×１０５个，活力均可达８０％。     

转Bt基因欧洲黑杨抗虫稳定性及其对天敌昆虫的影响

1997-2001年,对新疆玛纳斯平原林场的转Bt基因欧洲黑杨试验林进行了食叶害虫(杨尺蠖)和杨梦尼夜蛾危害调查,转基因试验林叶片平均损失率均低于10%,试验林地虫口密度由1997年的18头·m-2降低到2001年的8头·m-2,而对照林地虫口密度却呈上升趋势. 2005年,位于北京怀柔的转Bt基因欧洲黑杨试验林受杨尺蠖危害,叶片损失率不超过20%,而当地其它杨树林叶片损失率高达90%.在转Bt基因欧洲黑杨林(新疆玛纳斯)中,寄生靶标害虫的天敌种类、数量和寄生率均高于对照林,对从试验林中采集的靶标昆虫的蛹进行接种试验,与对照相比,寄生蜂出蜂率和数量均无明显差异,寄生蜂也无异常,说明转Bt基因欧洲黑杨未对天敌昆虫产生明显不利影响.     

741杨双Bt基因的遗传转化及转基因株系的抗虫性

以含有Cry3Aa基因的重组质粒pBCC3为基础,利用PCR和DNA重组技术,从pBCC3中克隆出抗虫基因Cry3Aa,将其正向插入载体pCAMBIA1305的CaMV35S启动子和NOS终止子之间,构建成pCAMBIA1305-Cry3Aa植物表达载体,并导入根癌农杆菌EHA105。采用农杆菌介导的遗传转化法,将Cry3Aa基因转入已转Cry1Ac+API基因的741毛白杨无性系pB29中,获得转双Bt基因的741杨。在含潮霉素的培养基中进行多次继代筛选,获得抗性稳定的无性系9个,编号为pCCA1—pCCA9。采用特异引物分别对转基因植株进行PCR检测,结果显示Cry1Ac基因稳定存在于pB29中,Cry3Aa基因已整合到各无性系的基因组DNA中。ELISA毒蛋白检测,转基因株系都有Cry1Ac和Cry3Aa杀虫蛋白表达。用转基因植株叶片进行柳蓝叶甲(鞘翅目)和美国白蛾(鳞翅目)室内饲虫试验结果表明,转基因植株具有双抗性。根据对测试昆虫的致死率划分高中低3个抗性水平,其中pCCA2,pCCA5,pCCA6,pCCA9具有双高抗;pCCA3,pCCA4和pCCA7对柳蓝叶甲表现出中、低抗性,对美国白蛾则高抗;而pCCA1表现对美国白蛾的极低抗性,对柳蓝叶甲则高抗。     

北美鹅掌楸组培快繁技术体系的建立

通过北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera)种子诱导的无菌苗茎段,建立北美鹅掌楸的组培快繁体系,种子接种10d后开始萌动,实验的4种培养其中,最好的培养基是MS+3%蔗糖,种子萌发率达38.4%;MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1 mg/L是最好的外植体分化培养基,其增值率达2.04倍;小芽丛在MS+6-BA0.5 mg/L+NAA0.05mg/L上外植体分化数最高,达2.45倍,芽茁生长较好;芽苗在1/2MS+IBA0.5 mg/L+NAA0.1 mg/L生根培养基上,13 d后开始生根,生根率最高达66.7%,炼苗移栽20 d后苗木成活率达80%以上.     

黄山栾快繁体系建立优化培养方案研究

以黄山栾优良单株繁殖的种子为外植体,采用L9(34)正交试验设计方法,探索建立黄山栾快繁体系。通过实验,找到适合黄山栾种子无菌体建立的方法是:酒精消毒1min,升汞消毒10min;把消毒后种子放在湿润的无菌滤纸上可快速培养无菌苗;试验结果得出:适合侧芽生长的培养基是:MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.01mg/L;适合侧芽伸长生长的培养基组合是:MS+6-BA1.2mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.01mg/L;适合茎段愈伤组织增殖的培养基是:MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+IBA0.03mg/L;适合诱导茎段再生芽生长的培养基是MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+IBA0.05mg/L。     

利用PMI选择标记进行杨树转基因体系的研究

[目的]利用不同于抗生素的PMI为选择标记基因的遗传转化体系,对杨树进行双抗虫基因(Bt和CpTI)的转基因研究.建立杨树以PMI为安全标记基因的转基因体系,为安全、高效的林木转基因育种研究提供实验依据.[方法]选择已有的转CpTI抗虫基因(利用Km^r选择标记获得)的美洲黑杨杂种优良无性系南林895杨(Populus ×euramericana ‘Nanlin895’)为受体材料,对杨树叶片、叶片分化芽、茎段生根的甘露糖敏感性等筛选优化,采用农杆菌介导的方法进行双抗虫基因的研究.[结果]较为适合的杨树叶片筛选培养基为:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1;叶片分化芽筛选培养基为:甘露糖10 g·L^-1和蔗糖20 g·L^-1;茎段生根筛选培养基:甘露糖8 g·L^-1和蔗糖22 g·L^-1.在此基础上,获得了转Bt和CpTI双抗虫基因的植株8株.[结论]初步建立了以PMI为安全标记基因的杨树转基因体系:确定了PMI筛选的最适选择压,成功构建了含PMI选择标记基因的植物抗虫表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化最终获得了转双抗虫基因植株.     

七叶树RAPD反应体系的优化

以七叶树新鲜叶片为材料,研究了七叶树RAPD分析过程中的影响因素包括Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合七叶树RAPD反应的PCR体系。即20μl反应体系中含有dNTP 0.25 mmol/L,Mg2+2.5 mmol/L,Taq酶1.0U,引物0.8μmol/L,DNA模板50ng。扩增程序为:94℃预变性5min,然后40个循环(94℃变性30 s,33℃退火40 s,72℃延伸60 s),最后72℃延伸10min,4℃保存。     

铜对海菜花种子萌发及幼苗生长的影响

采用营养液培养法,研究了不同铜离子(Cu2+)浓度(0mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L)对海菜花种子萌发及幼苗生长指标及部分生理指标变化的影响。结果表明,各浓度处理(0.1~10mg/L)Cu2+对海菜花种子发芽率与对照均无显著差异(p0.05);海菜花种子的发芽势、发芽指数与活力指数整体表现出随Cu2+处理浓度的增加呈下降趋势,当Cu2+处理浓度较高时,与对照差异显著(p0.05)。Cu2+明显降低海菜花叶片中叶绿素a、b及类胡萝卜素含量,且与对照差异显著(p﹤0.05)。随着Cu2+浓度的增加,超氧化歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性、可溶性蛋白质含量先升高后降低;过氧化氢酶(CAT)呈持续降低趋势,且与对照差异显著(p0.05)。该研究结果为海菜花的保护提供了一定的理论支持。     

4PU、NAA、IBA在中华猴猕桃微繁殖技术中的应用研究

研究结果表明:1.使用新型的苯基脲衍生物4pU与生长素配合,可明显提高茎段和离体叶片的分化,其活性约为6苄基氨基嘌呤、6-BA)、玉米素(ZT)的10倍。2.在附加4pU(1毫克/升)的培养基上,分化不定芽和茎段丛生芽,个体发育较弱,须经在低浓度4pU(0.3～0.5毫克╱升)和6-BA(1毫克/升)培养基中再培养,方可获得健壮的试管苗。3.中华猕猴桃试管苗在1/2MS+NAA_(0.5)+IBA_(0.5)的培养基中培养10天后,移栽成活率可达95％左右。     

成龄转基因银中杨试验林外源基因水平转移及土壤微生物连年监测

【目的】对成龄转JERF36基因银中杨——抗逆1号杨试验林进行连年生物安全性监测，评价抗逆1号杨可能引起的生态风险，为评估转基因杨树及转基因植物土壤环境安全性提供依据。【方法】以11年生抗逆1号杨、非转基因银中杨对照、林下杂草、林下土壤、试验林旁行道树下杨树实生苗叶片、土壤中筛选出的卡那霉素抗性菌株为材料，采用PCR扩增方法检测外源基因JERF36稳定性及水平转移潜在性，利用稀释平板法对9～11年生抗逆1号杨与非转基因杨对照林地的可培养微生物(细菌、真菌和放线菌)的种群数量进行分析。【结果】外源基因JERF36在抗逆1号杨中稳定存在，林下杂草、林下土壤、试验林旁行道树下杨树实生苗叶片、土壤中筛选出的卡那霉素抗性菌株的DNA样品中均未出现目的基因片段。9～11年生抗逆1号杨与非转基因对照间林下土壤中微生物总数量均无显著差异；不同年份间的抗逆1号杨和非转基因对照的林下土壤微生物数量均略有差异且趋势一致，其中6—8月土壤中微生物总量为9年生>10年生>11年生；9～11年生抗逆1号杨和非转基因对照林地土壤3大类微生物(细菌、真菌和放线菌)数量均无显著差异，各年变化趋势一致，在树木...     

金樱子SRAP-PCR反应体系的建立与优化

以广西南宁产的金樱子叶片为材料,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP-PCR反应体系中的Mg2+、dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物和模板DNA用量5因素进行了优化。结果表明:适用于金樱子SRAP-PCR的最佳反应体系为:反应总体积10μL,包含2.0 mmol/L Mg2+、0.4 mmol/L dNTPs、0.5 UTaqDNA聚合酶、3μmol/L引物、25ng DNA及10×PCR Buffer;各因素对PCR反应影响由大到小依次为:Mg2+、DNA、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶。用7份不同来源的金樱子材料对优化的SRAP-PCR反应体系进行验证,均获得了条带清晰、多态性丰富的扩增图谱,证实了该体系的稳定可靠。     

云南箭竹基因组DNA的提取及RAPD反应条件的优化

用改良的SDS法从云南箭竹硅胶干燥的叶片中提取基因组DNA进行RAPD扩增。通过正交法对RAPD反应条件优化,6个试验因子的最适条件为:模板DNA1.5ng/μL,随机引物0.8～1.0μmol/L,dNTPs浓度0.1～0.15mmol/L,Mg2+浓度2.0～2.5mmol/L,Taq酶用量0.5～1.0U。最佳热循环参数为:94℃预变性2min,之后进行40次循环(94℃变性30s,36℃退火60s,72℃延伸90s),最后72℃总延伸7min后在4℃终止反应。