桃花芽休眠解除SSH文库构建及相关基因表达分析

 为了深入研究桃花芽休眠的分子机制,利用抑制差减杂交技术（SSH）,以解除休眠期的花芽的RNA为实验方Tester,以休眠期花芽的RNA为驱动方Driver,构建休眠解除cDNA文库,测定分析了180 个上调表达的cDNA 片段,测序成功128个,除去冗余序列,得到28个单一序列。对序列进行BLAST比对及功能注释,发现这些序列分别属于新陈代谢、氧化还原、信号转导、抗性相关等类别基因。运用qRT-PCR 技术对HisH3、Dhn 和Metallothionein基因进行检测,结果表明它们在花芽休眠解除过程中均上调表达。     

高温胁迫下番茄叶片差异表达基因的cDNA-AFLP鉴定

 为鉴定番茄高温胁迫响应基因,应用cDNA-AFLP技术,以番茄耐热品系Saladette幼苗为研究对象,对高温胁迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。通过768对引物组合的筛选,共分离得到187个差异表达的转录衍生片段(TDF),其中增强表达或高温胁迫下特异性表达TDF153条,抑制表达34条。对其中47个TDF进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：34个TDF与NCBI或TIGR已有序列同源（E-Value<10^-5）,功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等,另有13个TDF无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。     

‘短柄樱桃’花芽休眠解除过程中差异表达基因的研究

 以中国樱桃的优良品种‘短柄樱桃’（Prunus pseudocerasus Lindl.‘Duanbing’）的花芽为材料,采用mRNA 差异显示技术,分析休眠解除的过程中相关差异表达基因。共克隆获得79 个差异cDNA片段;通过半定量RT-PCR 验证,确定18 个阳性差异cDNA 片段为休眠解除相关候选基因;休眠解除过程中上调的基因片段11 个,下调的7 个。测序及同源性比对结果显示：差异表达基因主要参与糖代谢、信号转导、跨膜转运及氧化还原等反应过程。这些基因在‘短柄樱桃’休眠解除阶段可能起到直接或间接的作用。     

油桃开花时间调控基因在花芽休眠过程中的表达分析

对拟南芥中21个调控开花时间的基因进行NCBI blast比对后找到桃中所对应的同源基因,以拟南芥的突变体表型及基因注释功能为依据分为促进开花和抑制开花两类。以7年生‘曙光’油桃花芽为试材,利用水培法测定萌芽率,界定休眠分为诱导期、自然休眠期和休眠解除期3个阶段。研究结果表明诱导期和自然休眠期内花芽单芽质量上升平缓,休眠解除后突然升高到0.12 g,翌年2月9日达到0.15 g;而花芽含水量从诱导期开始缓慢下降,在休眠解除时达到最低水平（39%）,之后平稳上升到53%。聚类分析发现,两类基因对开花的影响与其在休眠进程中的表达趋势不存在必然的相关性。利用荧光定量PCR（RT-PCR）技术测定目的基因在休眠过程中的表达特性,发现在休眠进程（自然休眠和休眠解除期）中PpFT-like和PpCO-like表达量逐渐升高,推测其可能与需冷量积累相关。PpDDL-like、PpCCT-like、PpELF8-like、PpAMP1-like、PpHUA2-like和PpHUB1-like表达量先升高后降低,在休眠解除时达到最高水平之后随休眠解除下降,与花芽休眠解除进程一致,推测其可能参与调控花芽休眠解除过程。     

应用cDNA-AFLP技术分离草菇冷诱导表达基因

 采用cDNA-AFLP技术筛选获得了5个草菇冷诱导表达基因片段VC1、VC2、VC3、VC4 和VC5。测序结果表明, 5个DNA片段大小分别为247 bp、219 bp、172 bp、350 bp和171 bp。同源性BLAST搜索结果显示, VC1、VC2、VC3、VC4和VC5片段目前都没有同源的核酸序列; VC1片段翻译的蛋白质序列与粗糙脉孢菌(Neurospora crassa) 的假拟蛋白具有一定的同源性, VC2片段翻译的蛋白质序列与水稻的AMP脱氨酶具有一定的同源性, VC3片段翻译的蛋白质序列与Danio rerio的糖原合酶激酶3α具有较高的同源性, VC4片段翻译的蛋白质序列与Leuconostocm esenteroides的假拟蛋白有一定的同源性, VC5片段翻译的蛋白质序列没有搜索到同源序列。     

番木瓜果实成熟相关基因的cDNA-AFLP分析及克隆

 为了探讨番木瓜果实成熟机理,利用cDNA-AFLP技术对破色期和半黄期的番木瓜果实进行基因差异表达分析,获得了50个与果实成熟相关的差异基因片段,其中28个与GenBank数据库中的功能基因同源,分别参与了果实成熟过程中基因表达调控,DNA与蛋白质合成及运输,蛋白质降解,能量代谢,营养物质代谢和逆境胁迫反应等过程。在差异片段序列基础上设计特异引物,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术成功克隆了4条差异基因cDNA全长,分别命名为CpGMP、CpPAA1、CpPOD和CpMYB。半定量RT-PCR分析结果表明,随着果实的成熟衰老,4个基因的表达量相应变化,说明其可能参与果实的成熟过程。     

杭州地区不同需冷量甜樱桃品种休眠阶段花芽转录组分析

为探究中国南方暖湿地区甜樱桃适栽品种花芽休眠阶段的分子调控机制,以杭州地区种植的2个不同需冷量甜樱桃品种‘布鲁克斯’和‘萨米脱’为材料,分别于休眠前期（S1）、内休眠期（S2）和萌芽前期（S3）采集花芽,通过转录组测序比较2个品种间的基因表达差异。分析表明,S1、S2和S3时期分别获得343、671和1 588个差异表达基因,其中S3的差异基因数最多。GO分析表明,细胞组建、细胞代谢过程、刺激响应以及转运蛋白活性相关的基因在3个时期品种间均表现出显著差异。KEGG分析表明,S3富集的差异基因数及相关代谢途径最多,主要集中在糖代谢和蛋白质合成加工相关途径以及植物—病原互作、植物激素信号转导等途径,表达趋势分析显示部分差异基因可能参与调控甜樱桃花芽休眠状态的转换。通过转录因子预测分析,筛选到包含9个转录因子家族的42个差异表达转录因子,其中AP2/ERF、MYB、WRKY、C2H2、C3H和MADS-box家族的13个转录因子在S2的表达量显著高于S1和S3,表明这些转录因子可能参与了甜樱桃花芽休眠期的调控。     

梨两个休眠相关MADS-box 基因特征及在其休眠过程中的表达分析

 PpMADS1 和PpMADS2 是从‘酥梨’（Pyrus pyrifolia white pear group‘Suli’）休眠芽转录组 文库筛选的两个与休眠相关的MADS-box 基因序列。为了解序列的特征,对其进行了相关生物信息学分 析,并以‘翠冠’和‘圆黄’梨为试材,用实时定量PCR 技术分析其花芽休眠不同阶段的表达变化。结 果表明：两个基因都具有MADS-box 家族的特征序列MIKC-基序,PpMADS1 和PpMADS2 分别与日本梨 （P. pyrifolia‘Kosui’）休眠相关的两个MADS-box 基因PpMADS13-1 和PpMADS13-2 聚在一起,且单独 聚为一支,与李属植物休眠相关的MADS-box 基因关系最近。在两个品种的休眠过程中,PpMADS1 和 PpMADS2 的表达呈现相似的变化趋势,都有一个表达高峰,但‘翠冠’梨PpMADS1 和PpMADS2 的表 达高峰均出现在11 月15 日,而‘圆黄’梨PpMADS1 的表达高峰延后到12 月30 日,PpMADS2 的表达 高峰出现在12 月15 日。两个品种PpMADS1 和PpMADS2 的表达高峰都出现在内休眠解除之前,随内休 眠解除其表达量下调,在生态休眠阶段表达量维持在较低的水平。据此推测PpMADS1 和PpMADS2 的表 达对梨芽内休眠的解除具有调控作用     

利用cDNA-AFLP研究辣椒细胞核雄性不育差异表达基因

辣椒细胞核雄性不育两用系在辣椒杂交种配制方面有着非常重要的应用,为了进一步了解其不育性的分子机理,利用cDNA-AFLP对辣椒细胞核雄性不育两用系‘AB23’可育株和不育株花蕾的mRNA指纹图谱进行了初步分析。结果表明:共获得19个差异表达的TDF,均来自可育株。在可育株花蕾中得到了19个TDFs,其中13个TDFs功能已知,2个功能未知,4个没有找到同源序列。对13个已知序列的分析表明,这些基因涉及了细胞的代谢、转录、胞间运输和信号转导等相关过程。通过半定量RT-PCR技术对获得的19个TDFs进行验证,其表达特征与cDNA-AFLP结果一致。     

不同化学物质打破葡萄、桃休眠的研究

以保护地栽培的葡萄、桃为试材,对氰氨类、细胞分裂素、赤霉酸和KNO3打破休眠的效果进行了研究。结果表明,1.5%单氰氨、11%石灰氮可明显促使葡萄提前萌芽,提早着色9-10d;50mg/LGA3和100mg/L6-BA对打破休眠基本无效。TDZ与单氰氨混用提高萌芽率的效果最好。在2个葡萄品种上,均没有观察到单氰氨或石灰氮处理对果穗或果实品质性状的不良影响。在华光油桃上,没有观察到化学物质对提早开花或成熟有明显的作用。对葡萄和桃上应用化学物质打破休眠的有关问题进行了讨论。     

不同需冷量桃品种芽休眠诱导期间的生理变化

以3a生低需冷量春捷毛桃和高需冷量青州冬雪蜜桃为试材,研究桃芽自然休眠诱导期间的生理变化。结果表明,在自然休眠诱导期间,桃芽中水分质量分数和存在状态、膜透性、淀粉和可溶性糖质量分数以及呼吸代谢发生重大变化。伴随着自然休眠的发展,桃芽中水分质量分数、自由水/束缚水比值和膜透性迅速降低,且青州冬雪蜜桃先于春捷毛桃下降,下降速度青州冬雪蜜桃大于春捷毛桃;而淀粉和可溶性糖质量分数则迅速增加,青州冬雪蜜桃先于春捷毛桃增加,增加速度青州冬雪蜜桃大于春捷毛桃;呼吸强度逐渐降低,同时呼吸途径发生重大变化,其中蛋白质和脂肪的三羧酸循环途径的容量急剧增加;糖酵解—三羧酸循环途径的容量呈不规则变化;磷酸戊糖途径的容量逐渐降低;剩余呼吸途径的容量逐渐升高。     

Screening differentially expressed genes involved in apoptosis of primary cultured rat cerebellar granule neurons by mRNA differential display RT-PCR

AIM: To Screen and identify differentially expressed genes that involved in apoptosis model in rat cerebellar granule neurons (CGNs).METHODS: The rat cerebellar granule neurons were isolated and primarily cultured.Fluorescent differential display RT-PCR (FDD RT-PCR) was performed to screen differentially expressed ESTs in the apoptosis model of primarily cultured rat CGNs.ESTs were subcloned into pGEM-T EasyTM vector and then sequenced.Alignment assay in non-redunant database was applied for encoding information.Reverse Northern blotting was used to appraise the results from DDRT-PCR.RESULTS: 164 pieces of differentially expressed ESTs were obtained by FDDRT-PCR.17 of them were subcloned and sequenced.5 ESTs of 17 were confirmed to be positive results by reverse Northern blotting.CONCLUSION: DD-PCR is a rapid,simple-operation and sensitive method for screening differentially expressed genes,which would contribute to the molecular mechanisms of apoptosis/survive of CGNs.     

高温胁迫下番茄叶片差异表达基因的cDNA-AFLP分析

为鉴定番茄高温胁迫响应基因,应用cDNA—AFLP技术,以番茄耐热品系Saladette幼苗为研究对象,对高温胁迫早期叶片基因表达进行了mRNA指纹分析。通过768对引物组合的筛选,共分离得到187个差异表达的转录衍生片段（TDF）,其中增强表达或高温胁迫下特异性表达TDF153条,抑制表达34条。对其中47个TDF进行了克隆、测序和序列分析。结果表明：34个TDF与NCBI或TIGR已有序列同源（E—Value〈10^-5）,功能涉及信号传导、转录调控以及逆境诱导蛋白等,另有13个TDF无同源序列或同源性低,预测是一些未知功能基因。     

温度对甜樱桃花芽酚类物质含量和相关酶活性及休眠的影响

以7年生甜樱桃红灯(PrunusaviumL.cv.Hongdeng)带有花芽的离体枝条为试材,研究了不同温度对红灯花芽酚类物质含量、相关酶活性及萌芽率的影响。结果表明,不同温度处理对酚类物质含量影响效果不同,自然休眠前期低温(5℃)减缓了酚类物质的积累,中期提前达到其高峰并进入下降阶段,后期加速其降低;高温(20℃)则效果相反,变温(5℃/20℃)的效果不明显。自然休眠的不同时期,不同的温度处理对PAL和PPO活性的影响效果也不相同,低温(5℃)在休眠前期抑制PAL活性的增长而提高了PPO活性,中期使PAL活性迅速降低的同时却加速了PPO活性的升高;后期降低了PAL活性,提高了PPO活性。高温(20℃)的作用效果与低温(5℃)相反。变温(5℃/20℃)对PAL和PPO活性的影响效果不明显。低温(5℃)在自然休眠的3个阶段都能打破休眠促进萌发;高温(20℃)抑制了花芽的萌发;变温(5℃/20℃)对花芽的萌发影响不大。     

利用cDNA．AFLP技术鉴定甘蓝显性核不育基因相关表达序列

 利用cDNA—AFLP技术， 比较分析了一个甘蓝与两个青花菜自交系回交转育的显性核基因雄性不育材料与对应可育亲本植株花蕾发育过程中基因表达的差异。将花蕾混合提取RNA合成eDNA建立6个eDNA池，分析128个弓l物组合获得了26000个片段，共鉴定24个片段与雄性不育相关，其中13条表现为质的差异，11条表现为量的差异；将其中引物组合A16T15产生的300 bp左右的差异片段进行克隆测序，BLAST结果表明，该序列与花粉特异性相关的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性达89％ 。     

Identification of differentially expressed genes during flower opening by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray analysis in Eustoma grandiflorum

The forward and reverse suppression subtractive cDNA libraries were constructed in petals of Eustoma grandiflorum at bud stage (stage 1) and anthesis (stage 7). Approximately 1000 clones were isolated from stage 1- (S1) and stage 7-specific (S7) libraries. The clones were sequenced and assembled, which yielded 98 contigs and 444 singletons. BLAST search was conducted on these assembled sequences. Generally, probes isolated from the S7 library exhibited higher expression at stage 7 by microarray analysis, as did those of the S1 library at stage 1. A clone set from the S7 library contained genes from later steps of anthocyanin biosynthesis pathway, terpene synthases, GAST (gibberellic acid-stimulated) family proteins, xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, glycosidases, and stress- and senescence-related proteins. In contrast, the S1 library contained genes associated with flavonol biosynthesis, phenylpropanoid metabolism, terpenoid metabolism, and floral organ development. Gene expression profiling for flavonoid biosynthesis was in accordance with preferential accumulation of flavonols at bud stages and anthocyanins at anthesis.     

Transcriptome profiling reveals differentially expressed genes associated with wizened flower bud formation in Chinese pear (Pyrus bretschneideri Rehd.)

Flower buds are very important for pear yield; non-germinated flower buds become wizened and drop from the branch, reducing pear production. However, little research has focused on the study of wizened flower bud (WB) formation in spring. In order to elucidate the mechanism of WB formation in pear, physiological indices relating to plant hormones and antioxidases were measured. We found that activities of peroxidase (POD) and superoxide dismutase (SOD) were higher and lower, respectively, in WBs than in normal flower buds (NBs). The contents of indole acetic acid (IAA), gibberellin (GA), and cytokinin (CTK) were lower in WBs, while the level of addition of abscisic acid (ABA) was higher in WBs than in NBs. Differentially expressed genes (DEGs) were surveyed between WBs and NBs. In total, 23 DEGs relating to POD and SOD were detected from GO (Gene Ontology) enrichment, and 29 DEGs associated with plant hormone biosynthesis were found from the KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) pathway. Notably, the expression patterns of these 52 genes were consistent with variations of antioxidase activities or hormone contents. Because POD and SOD are stress-response enzymes, the differences in POD and SOD activities between NBs and WBs indicated that WB formation in pear could result from ambient environmental stresses that influence expression levels of hormone biosynthesis genes.     

短时间高温处理下桃芽淀粉和可溶性糖含量变化与自然休眠解除的关系

以6年生曙光油桃为试材,研究40℃、45℃、50℃3个梯度高温短时间处理对花芽和叶芽的存活率、萌芽级数以及淀粉和可溶性糖含量的影响,探讨短时间高温处理对桃芽自然休眠的调控效应。结果表明:随短时间高温处理时期的推迟,处理温度的升高,处理持续时间的延长,短时间高温处理对桃芽自然休眠的解除作用增强。11月30日高温处理中,40℃高温处理对桃芽自然休眠解除呈负调控效应,其萌芽级数和可溶性糖含量均低于对照,而淀粉含量高于对照;45℃和50℃高温处理对桃芽自然休眠解除呈正调控效应,其萌芽级数和可溶性糖含量与对照相比明显升高,而淀粉含量显著降低,虽然部分花芽和叶芽因高温处理而死亡,但是在存活芽中短时间高温对桃芽自然休眠的解除作用明显增强。12月10日高温处理中,40℃高温处理对桃芽自然休眠解除的调控效应不明显,45℃和50℃高温处理和11月30日处理相同,具有正调控效应,只是前者对桃芽自然休眠的解除效果优于后者。不同高温处理桃芽的萌芽级数和淀粉含量及可溶性糖含量之间的相关性分析表明,淀粉含量的降低,可溶性糖含量的升高即淀粉向可溶性糖的快速转变是高温解除休眠的部分原因。