重组绿脓杆菌外毒素A受体结构区蛋白的初步复性及细胞生物学？…

用逐步稀释透析法将将纯化的大肠杆菌表达的重组绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）受体结合区蛋白初步复性,复性后的可溶性蛋白用于竞争抑制ＰＥＡ的细胞毒性实验。将１０μｇ／Ｌ的ＰＥＡ与其敏感细胞１．９２９共孵育,３６ｈ左右可见细胞发生病变死亡,而同时加入复性的重组ＰＥＡ受体结合区蛋白的培养细胞也与未加ＰＥＡ阴性对照培养细胞一样仍分裂增殖,这种ＰＥＡ细胞毒性抑制人作用可持续到所有培养细胞老化死亡,结果表明,重组Ｐ     

含绿脓杆菌外毒素A受体结合区重组蛋白的纯化

将表达含绿脓杆菌外毒素（ＰＥＡ）受体结合区基因的质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ转化到大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,经ＩＰＴＧ诱导表达了含ＰＥＡ受体结合区的重组蛋白（称ＰＥ３４）。ＰＥ３４主要以包涵体形式存在于大肠杆菌中,用溶菌酶－脱氧胆酸钠法结合超声波裂解法破碎细菌,离心制备包涵体。用２ｍｏｌ／Ｌ脲洗涤包涵体后,包涵体纯度可达７５％,在８ｍｏｌ／Ｌ脲存在条件下,ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ－２００凝胶滤过,ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ离子交换层析纯化,获得ＳＤＳ－ＰＡＧＥ１条带的ＰＥ３４,纯度达９５．８％,得率为２４．５％。     

绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白基因重组与鉴定

为了获得高表达量重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白 ,以用作免疫原 ,从含有目的片段 (10 0 0 bp)的 p ET- 2 0 (b) B1 0 质粒切下目的片段 ,以正确阅读框架插入含有 T7lac启动子的 p ET- 2 8c( ) DNA中 ,构建了p ET- 2 8c( ) B1 0 质粒。用该质粒转化大肠杆菌 BL2 1 (DE3 )、BL2 1 (DE3 ) p L y S,经 IPTG诱导 ,BL2 1 (DE3 ) p L y S能高效表达目的蛋白。 SDS- PAGE、Western blot分析证实 ,该蛋白即是所需的蛋白 ,该重组蛋白占菌体总蛋白的 5 8%。     

重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白动物免疫保护试验

将绿脓杆菌外毒素A（PEA）受体结合区基因重组质料pET-28(c) B10转入大肠杆菌BL21（DE3）plys,诱导表达出的重组PEA受体结合区蛋白包涵体经脲素洗涤后，Sephacryl-2000分子筛层析，DEAE－SepharoseFF离子交换层析获得纯度为95．8％重组蛋白包涵体，将该蛋白免疫原免疫小鼠后，用PEA进行不同时间攻毒，观察到最佳保护时间为14d左右，主要的病理变化出现在肝脏和肾脏。     

绿脓杆菌外毒素A的纯化

用绿脓杆菌ＰＡ１０３株接种于ＴＳＡ甘油培养基３２℃培养，产生绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ），经流水透析除盐、ＤＥ－５２纤维素阶段洗脱、硫酸铵分级沉淀、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５除盐、ＤＥ－５２纤维素梯度洗脱、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００分子筛层析，纯化了绿脓杆菌外毒素Ａ。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，纯化后的毒素为单一蛋白带，分子量约６６０００；对普通小鼠ＬＤ５０为０．２４μｇ蛋白。用ＰＥＡ抗血清作免疫印迹分析，进一步证实纯化的蛋白为ＰＥＡ，毒素约纯化了５００倍，总蛋白回收率约０．０２４％，毒素回收率约１１％。     

重组PEA受体结合区蛋白的免疫活性

为了观察重组绿脓杆菌外毒素 A(PEA)受体结合区蛋白在不同动物体内的免疫效果 ,将该蛋白纯化后免疫了小鼠、家兔、山羊等动物。对小鼠进行了攻毒实验 ,通过 EL ISA方法检测了家兔、山羊血清中抗体的消长规律。结果对小鼠的保护情况为 :最后 1次免疫后 14 d小鼠对 3倍 L D50 的 PEA攻毒保护率为 10 0 % ,2 1d保护率为 5 0 % ,2 8d后无保护效果。家兔和山羊免疫后 7～ 14 d达到峰值 ,2 1d后逐渐降低 ,2 8～ 35 d后降至免疫前水平     

绿脓杆菌外毒素A受体结合亚单位基因的克隆与表达

为防治绿脓杆菌感染造成的细胞坏死及多器官衰竭，本试验克隆了含绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）结合亚单位（Ⅰ区）和部分跨膜亚单位（Ⅱ区）编码３０９个氨基酸的约１０００ｂｐ的基因片段，以正确阅读框架将该片段置于原核高效表达Ｔ７启动子下游，构建了高效表达质粒ｐＥＴ－ＥＡＢ。转化宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭ１７４（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ后，经ＩＰＴＧ诱导４ｈ，均表达了外源目的基因蛋白，其中ＢＬ２１（ＤＥ３）和ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ的表达量明显高于其他宿主菌。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析，外源蛋白分子量约３４０００，与ＰＥＡⅠ区和部分Ⅱ区基因所编码的蛋白理论估计值相符，命名为ＰＥ３４。凝胶薄层扫描显示，ＰＥ３４含量占菌体蛋白总量的５６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔｉｎｇ检测证明ＰＥ３４为所需目的蛋白     

抗绿脓杆菌外毒素A酶标抗体的制备及其应用

从病死羊体内分离到绿脓杆菌并提取出外毒素A(PEA),再以此毒素作为抗原加油佐剂制成乳化抗原免疫家兔,获得高免血清并提取免疫球蛋白G(IgG);用过碘酸钠法将过氧化物酶标记抗PEA抗体(IgG),制成酶标抗体,经检验,酶标抗体结合物中的HRP浓度和Ab(IgG)浓度分别是0.0608 mg/mL和0.336 mg/mL;HRP/Ab(IgG)克分子比值为1.724%;酶(HRP)结合率是11.15%.利用该酶标抗体以ELISA夹心法对羊体内抗PEA抗体含量进行了检测,结果证明,用酶标抗体ELISA法比用平板凝集实验法检测的抗体效价平均高出二个滴度,表明制备的PEA酶标抗体具有灵敏度高、特异性强的优点.     

绿脓杆菌外毒素A recA基因的融合及融合蛋白的表达

将绿脓杆菌ｒｅｃＡ基因克隆到ｐＵＣ１８中，构建了中间载体ｐＵＣＲ１８；然后以正确的向位及阅读框架将ｒｅｃＡ基因亚克隆到毒性基因缺失的绿脓杆菌外毒素Ａ（ＰＥＡ）基因中，构建了ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因质粒ｐＥＲＡ；融合基因经ＢａｍＨＩ及ＥｃｏＲＩ酶切，以正确阅读框架插入带有Ｔ７表达启动子的质粒ｐＥＴ－１７ｂ，构建了可表达ＰＥＡ－ｒｅｃＡ融合基因的质粒ｐＥＲＡ－１７ｂ。经酶切分析及ＰＣＲ扩增检测证明，绿脓杆菌ｒｅｃＡ已插入ＰＥＡ毒性基因中。ｐＥＲＡ－１７ｂ转化到ＤＥ３溶原态大肠杆菌ＨＭＳ１７４中，经ＩＰＴＧ诱导，表达了ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和凝胶薄层扫描ＰＥＡ－ＲｅｃＡ蛋白，表明ＰＥＡ－ＲｅｃＡ的分子量约为９００００，与理论推算相符，表达率占菌体总蛋白量３．４２９％，用ＰＥＡ抗血清和抗ＲｅｃＡ单克隆抗体作免疫印迹分析，ＰＥＡ－ＲｅｃＡ与它们都有免疫学反应     

绿脓杆菌PA-SD-1株外毒素AⅢ区基因的克隆及序列分析

利用PCR技术，以绿脓杆菌羊分离株（暂命名为PA－SD－1株）的染色体DNA为模板，成功扩增出该菌的主要致病基因（绿脓杆菌外毒素A）Ⅲ区基因。将该PCR扩增片段与pPGEM^R-T Easy载体连接，获得了含有目的片段的重组质粒（命名为PA－SD－ETA）。序列测定结果表明。该菌株与其他已报道的绿脓杆菌菌株有较高的同源性，而局部出现单个碱基的点突变。点突变导致的氨基酸的性质有较大改变。     

P[1]型A群牛轮状病毒VP8重组蛋白的表达与免疫原性研究

【目的】 利用原核表达系统表达P[1]型A群牛轮状病毒(BRVA) VP8重组蛋白,并评价其反应原性与免疫原性。【方法】 根据国内流行毒株RVA/Cow-tc/CHN/SDA2/2018/G6P[1] VP8基因序列(GenBank登录号:MN937517)进行密码子偏好性优化,构建P[1]型BRVA VP8大肠杆菌原核表达系统,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析重组蛋白表达形式。镍琼脂糖亲和层析纯化重组蛋白,Western blotting鉴定重组蛋白与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合能力,并将P[1]型BRVA VP8重组蛋白免疫兔,首免后2周加强免疫1次,共免疫2次。分别用间接ELISA方法与中和试验评价其免疫原性。【结果】 本研究成功构建P[1]型BRVA VP8重组蛋白的原核表达系统;SDS-PAGE结果显示,高效表达大小为20 ku的P[1]型BRVA VP8重组蛋白,以可溶形式存在;Western blotting结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白能与兔抗G6P[1]型BRVA血清特异性结合;间接ELISA结果显示,P[1]型BRVA VP8重组蛋白亚单位疫苗能诱导兔产生抗体,兔首免1周后抗体开始出现并迅速上升,于第3周达到高峰,至第5周仍维持在较高水平;中和试验结果显示,第2次免疫后抗体最高的兔血清对G6P[1]型和G8P[1]型BRVA的中和效价分别为1∶17 783和1∶64。【结论】 本研究成功构建原核表达系统表达P[1]型BRVA VP8重组蛋白,并证实其具有良好的反应原性及免疫原性,为研制BRVA亚单位疫苗奠定基础。     

猪肺炎支原体P97蛋白单克隆抗体的制备、表位鉴定及其初步应用

为了制备能够用于阻断ELISA检测的猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）单克隆抗体（MAb）,本研究将原核表达的Mhp J株P97蛋白C末端包含R1区的肽段（P97CR1）作为免疫原免疫BALB/C雌鼠,筛选获得一株能稳定分泌抗Mhp P97蛋白MAb的杂交瘤细胞株A3。鉴定结果显示,A3 MAb是IgG1亚类,轻链为κ链。Western blot结果显示A3 MAb能够和原核表达纯化的P97CR1蛋白特异性反应,并且在流式细胞仪分析中能够识别天然的Mhp。通过逐渐截短表达分析该MAb识别的表位序列为LDDNLQ,该抗原表位在Mhp菌株中高度保守。阻断ELISA初步试验结果显示,A3 MAb与蛋白抗原的结合能够被Mhp高免阳性血清阻断。该MAb的制备为进一步建立特异性强、灵敏度高的Mhp阻断ELISA检测方法奠定了基础。     

重组新城疫病毒HN与F蛋白免疫保护作用的初步研究

95只1日龄SPF鸡随机分成5组,1～4组分别于10日龄接种φT4、φT4-Z1-HN、φT4-Z1-F、φT4-Z1-HN φT4-Z1-F油乳剂疫苗,第5组接种ND弱毒疫苗,25日龄加强免疫一次.结果表明,重组HN和F蛋白均能诱导ND抗体产生,但抗体水平显著低于用弱毒疫苗免疫的第5组.60日龄时用100LD50NDV强毒株攻毒,第1组鸡100%发病和死亡,φT4-Z1-HN和φT4-Z1-F免疫组的死亡率分别为50%和15.8%;用φT4-Z1-HN φT4-Z1-F和ND弱毒疫苗免疫的第4、5组鸡无一死亡.     

犬ANP32蛋白多态性及其对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响

【目的】探索犬酸性核磷蛋白32(canis acidic (leucine-rich) nuclear phosphoprotein 32 ku, caANP32)对不同物种A型流感病毒(Influenza A virus, IAV) RNA聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因(caANP32A、caANP32B及caANP32E)的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05;P<0.01),在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因(P<0.01;P<0.05),在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异(P>0.05)。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接...     

O型口蹄疫病毒P1-2A基因重组杆状病毒的构建及其表达

设计合成特异引物,扩增O型口蹄疫病毒(O/FMDV)P1-2A基因,将其克隆至T载体上,通过Hind Ⅲ和Not Ⅰ双酶切P1-2A基因和真核转座载体pFastBac^TM Dual,构建重组转座质粒pFastBac-P12A,再将pFastBac-P12A转化入含穿梭载体Bacmid的受体菌DH10Bac,经重组筛选获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P12A。将Bacmid-P12A质粒转染Sf9昆虫细胞,出现典型CPE。病变细胞经Dot blotting和SDS-PAGE检测和分析,结果表明,O/FMDV P1-2A蛋白在Sf9细胞中获得表达,为O型FMDV特异性蛋白。     

共表达AsiaⅠ型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因重组山羊痘病毒的构建及鉴定

将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白前体P1-2A基因和蛋白酶3C基因与启动绿色荧光蛋白双向串连痘苗病毒启动子相连,以KpnⅠ为插入位点,将整体基因片段插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中,构建共表达重组山羊痘病毒转移载体pTK-P7.5-GFP-P12A3C。与疫苗弱毒株山羊痘病毒共转染BHK21细胞,经绿色荧光筛选,RT-PCR检测,成功获得能正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株vTK-3CP1-GFP。     

重组蓖麻毒素A链表达及其与天然蓖麻毒素毒性比较研究

本试验旨在制备有高生物活性的重组蓖麻毒素A链(r-RTA)并与天然蓖麻毒素(n-RT)进行毒性比较.根据NCBI公布的RTA序列合成基因片段,并将其克隆于pET-28a载体后,利用大肠杆菌进行原核表达,镍柱亲和层析纯化上清,500 mmol/L咪唑溶液洗脱获得可溶性r-RTA蛋白,通过SDS-PAGE及Western blotting对其进行鉴定并用ELISA测定其免疫原性后,对r-RTA与n-RT进行动物和细胞试验毒性比较研究.结果显示,该r-RTA在上清中表达率为31.2%;每升细菌培养物纯化后可得20 mg目的蛋白,纯度≥90%,大小为32 ku.其免疫原性约为n-RT的1.27倍;通过获取的n-RT细胞半抑制浓度(IC₅₀为0.01 μg/mL)及动物半数致死量(LD₅₀为(3.27±0.44) μg/kg),以相同浓度进行细胞感染和动物攻毒试验,结果显示,同等剂量下,在细胞试验中,n-RT毒力是r-RTA的2 700倍;在动物试验中,n-RT组对动物致死率为40%,r-RTA组动物无死亡.结果表明,单独RTA,在没有RTB协助下,具有一定的毒性作用,但毒力将显著降低.该结果将为开发基于RTA的蓖麻毒素疫苗提供重要数据和理论支撑.     

A型塞尼卡病毒检测方法及疫苗研究进展

A型塞尼卡病毒（Senecavirus A,SVA）也称为塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus,SVV）,属于小RNA病毒科塞尼卡病毒属成员。SVA主要引起猪的水泡性疾病,与口蹄疫、水泡性口炎、猪水泡病等临床症状相似,可导致新生仔猪急性死亡,严重影响养猪业发展。自2015年广东省发生SVA感染以来,中国多省份陆续有该病发生的报道。当前,中国因猪群缺乏针对SVA的免疫屏障,加之该病传染性较强,存在大范围暴发的潜在风险。如何有效防控SVA感染是迫切需要解决的问题。目前已开发出多种SVA诊断方法用于进行实验室及现场条件下早期的鉴别诊断。SVA的分离鉴定、原位杂交和免疫组化可用于检测病原体的存在及其与组织内形态学变化关系;血清学诊断方法包括基于不同结构蛋白的间接ELISA方法、竞争ELISA方法、均相光激化学发光免疫技术和病毒中和试验,用免疫学方法检测抗体有助于了解SVA感染进程,是临床诊断的主要手段;病毒核酸检测方法主要有PCR技术、等温扩增技术、基因组测序等分子生物学技术,在病毒感染的早期快速检测及检测新发病毒中具有重要作用。目前仍无商品化疫苗预防SVA感染,但科研人员已研发出了灭活疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗和亚单位疫苗等多种具有潜力的候选疫苗。笔者系统总结了SVA检测方法及疫苗研发的最新进展,以期为SVA感染的防控提供参考依据。