半巢式RT-Reahime PCR检测马铃薯Y病毒脉坏死株系

马铃薯Y病毒脉坏死株系（Potato virus Y,PVY^n）是马铃薯中一个非常重要的病毒病害。本文根据PVY^n基因组中RNA依赖的RNA聚合酶基因序列保守区域,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式RT—RealtimePCR检测PVY^n的新方法。该方法采用E．Z．N．A^TM．陕速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术。第二步半巢式RT-Realtime PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、Realtime PCR等方法高。实验结果表明,该方法检测灵敏度可达4fg／μL植物总RNA。     

半巢式反转录实时荧光PCR检测马铃薯黑环斑病毒

本研究根据基因组中RNA依赖的RNA聚合酶(RDRP)保守序列,设计合成了3条巢式PCR引物和1条TaqMAN荧光探针,建立了半巢式反转录实时荧光PCR检测PBRSV的新方法.该方法采用E.Z.N.A TM快速提取植物总RNA,并有机地结合了巢式PCR和TaqMAN探针检测技术.第二步半巢式反转录实时荧光PCR既是对第一步信号的进一步放大,也是对第一步PCR产物的确认,因此,检测的准确性、灵敏度比巢式PCR、单重Realtime PCR等方法高.实验结果表明,该方法检测灵敏度可达300fg/μL植物总RNA.     

半巢式-RT-Realtime PCR检测李痘病毒

李痘病毒(Plum pox virus,PPV)是我国重要的植物检疫性有害生物。本研究根据PPV中CP基因(coat protein gene)的保守序列,设计了3条PCR引物和1条TaqMan探针,建立了半巢式-RT-RealtimePCR检测PPV的方法。该方法有机地结合了巢式PCR和实时荧光PCR技术;3条引物形成的2套PCR体系相互验证,有效提高了结果的准确性;荧光探针有效提高了检测的灵敏度。实验结果表明,本方法准确、灵敏、简便、快速,检出低限可达37fg/μL植物总RNA。     

半巢式RT-PCR检测进口大豆中菜豆荚斑驳病毒的研究

 菜豆荚斑驳病毒(Bean pod mottle virus,BPMV)在美国东部和南部的大豆产区广泛分布。该病毒能够造成3%~52%的产量损失并使大豆品质降低,目前我国未见其分布。针对进口大豆种子的植物病毒检测,本文建立了半巢式RT-PCR技术检测BPMV的方法。该方法采用Trizol快速提取大豆种子病毒总RNA,并根据BPMV的外壳蛋白编码基因设计特异性引物,经第一轮RT-PCR和第二轮半巢式PCR扩增,分别得到275 bp和196 bp大小的特异性基因片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,该产物序列与BPMV的外壳蛋白编码基因存在91%~95%的高度同源性。检测灵敏度比较研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这2种方法高出103倍以上。     

双引物探针RT-Realtime PCR检测马铃薯A病毒

马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)是我国重要的检疫性有害生物。本研究根据PVA中CP基因(coat protein gene)的保守序列,设计了两套PCR引物和TaqMan探针,建立了双引物探针RT-RealtimePCR检测PVA的方法。该方法采用实时荧光PCR技术,有效地提高了检测的灵敏度;同时两套引物探针相互验证,有效提高了结果的准确性。实验结果表明,本方法准确、灵敏、简便、快速,检出低限可达0.5fg/μL植物总RNA。     

烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)和番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式RT-PCR方法对这两种病毒进行了检测,用Trizol快速提取病毒总RNA,并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物,经过第一轮RT- PCR和第二轮半巢式PCR扩增,TRSV样本分别得到359 bp和206 bp特异性片段,ToRSV样本分别得到340 bp和219 bp特异性片段。半巢式RT-PCR扩增产物的测序表明,TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88%～97%的同源性,ToRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96%～100%的同源性。研究显示,DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近,而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10~3倍以上。     

实时荧光RT-PCR检测辣椒轻斑驳病毒的初步研究

本研究选取辣椒轻斑驳病毒PMMoV、烟草花叶病毒TMV、黄瓜花叶病毒CMV和马铃薯Y病毒PVY作为试验材料,根据PMMoV衣壳蛋白(CP)RNA的序列特异性位点,设计出Taqman荧光探针及其引物,采用实时荧光RT-PCR技术对PMMoV进行快速检测,同时与ELISA方法进行了灵敏度比较,结果表明：该方法具有较高的灵敏度及较强的特异性,PMMoV检测结果为阳性,TMV、CMV和PVY均无荧光信号,为阴性,灵敏度是传统的ELISA方法的100倍,而且大大缩短了检测时间。该方法快速、准确、灵敏、简便、安全,具有实际应用价值,适用于植物病毒病害的快速检测。     

应用RT-Realtime PCR检测南芥菜花叶病毒

根据南芥菜花叶病毒不同分离物外壳蛋白（CP）基因的保守序列,设计合成引物和1条TaqMan荧光探针,建立了ArMV的反转录实时荧光PCR（RT-Realtime PCR）检测方法。该方法利用TaqMan荧光探针实时监测目的基因的扩增,实现PCR扩增与探针检测同时进行,实验结果表明该方法具有“灵敏、准确、简便、快速”的特点,适合于口岸对南芥菜花叶病毒的快速检测。     

10种植物病毒的基因芯片检测技术研究

 本研究设计了10种植物病毒和各种对照的探针, 将探针固定在醛基化玻璃片基上制备基因芯片。用常规的Trizol法提取植物总RNA, 根据病毒的外壳蛋白基因或复制酶基因设计特异性引物, 经RT-PCR扩增相应区段并用Cy3-dCTP进行标记。将标记的PCR产物与芯片杂交, 扫描仪对杂交结果扫描, GenePix Pro 4.0软件对杂交图像进行分析。结果表明, 该芯片可以从病毒感染样本中检测到特异性识别信号, 检测灵敏度比RT-PCR高10~100倍, 所以, 基因芯片能对植物病毒作出快速、准确的检测。