重庆部分地区猪无名高热病例中PRRSV的RT-PCR检测

利用RT-PCR技术,对2份重庆不同地区的疑似无名高热病例的肺、肝等组织病料进行了检测,结果均为阳性。为疾病的准确诊断及有效防控争取了宝贵的时间。     

鲢补体C7基因的克隆、表达和序列分析

补体系统经活化形成末端补体复合物,C7是将此复合物与目的细胞的细胞膜结合的重要分子。本研究从已有的cDNA文库中克隆鲢(Hypophthalmichthys molitrix)补体C7的cDNA,其全长2 625 bp,编码821个氨基酸。同源性分析表明,鲢补体C7与草鲤鱼的氨基酸序列相同率最高(为93%)。与已报道的硬骨鱼类补体C7相同,鲢补体C7具有一些保守的结构,如TSP1、LDLRa、MACPF、EGF、TSP1、CCP。对12尾鲢补体C7进行遗传多样性分析发现有6个突变位点,其中5个是同义突变,另外一个是非同义突变,确定6个等位基因。在鲢正常组织和嗜水气单胞菌感染的免疫器官组织中,对C7基因进行了RT-PCR表达分析,结果显示,正常状态下,鲢补体C7基因只在脾中表达,在感染嗜水气单胞菌12 h后,鲢C7基因在脑、鳃、心、肾、肝、肠、脾7种组织中迅速表达,随着病原的清除,补体C7基因表达量也逐渐降低直至停止表达,说明补体C7是一个与抗嗜水气单胞菌感染相关的基因。     

2014年中国不同地区对虾白斑综合征病毒ORF14/15和ORF23/24缺失区序列比较

对虾养殖面临诸多病害威胁,对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus, WSSV)是养殖对虾主要病原之一,WSSV不同地理株的变异可能导致WSSV毒力的变化。为了解2014年中国大部分地区WSSV ORF14/15和ORF23/24的变异情况,本研究选择2014年1月–8月期间采集的48份WSSV阳性样本,用特异引物扩增ORF14/15和ORF23/24片段,连接于T载体,转化至Top10中,筛选阳性克隆,测序分析不同样本之间的缺失差异。结果显示,能够扩增ORF14/15和ORF23/24样品的比例分别为43.75%和33.33%。在ORF14/15扩增中,分别扩增出1260 bp、1270 bp、1892 bp和2662 bp片段,与TH-96-Ⅱ比对共有4种缺失情况,即缺失6540 bp、6530 bp、5908 bp和5138 bp。而在ORF23/24扩增中,分别扩增出1140 bp和1146 bp片段,与中国台湾株(TW)比对有两种缺失情况,即缺失12070 bp和12064 bp。研究结果表明,WSSV在中国大部分地区存在一定程度的变异,而不同毒株之间在ORF14/15可变区差异比较明显,在ORF23/24可变区差异不大,但均具有大片段缺失。     

罗氏沼虾白斑综合症病毒WSSV ORF147片段的克隆、表达与序列分析

白斑综合症病毒WSSV(White Spot Syndrome Virus),是严重危害虾类养殖业的主要病原之一.本实验根据已知南美白对虾WSSV ORF147序列设计1对特异性引物,从患疑似白斑病毒病的罗氏沼虾中提取总DNA,用PCR法扩增得到1特异性片段.将该片段克隆进pET-28a( )载体,测序表明该片段全长1 475 bp,最大开放式阅读框为1 380 bp,编码459个氨基酸,预计其相对分子质量为51.9 kDa;与GenBank登录的WSSV ORF147序列(登录号AF369029)进行比对,核苷酸同源性为99%,证实为WSSV ORF147片段.将该片段在大肠杆菌E coli中进行表达,能获得相应的特异多肽条带.根据测序结果推导WSSV ORF147多肽在N端有信号肽序列,并且在氨基酸序列的122～144区间形成跨膜螺旋区.     

同时检测CSFV、PRRSV的二重RT-PCR方法的建立及其在临床样品检测中的初步应用

建立了1种一步法RT-PCR用于同时检测典型猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖呼吸道综合征病毒(PRRSV)的多重PCR诊断方法(Multiplex PCR,mPCR)。根据Genbank上公布的CSFV、PRRSV基因组全序列及部分序列,借助DNAStar和Oligo6.0基因序列和引物设计软件,设计2对特异性引物分别用于扩增CFSV、PRRSV病毒777bp和434bp的目的片断。该mPCR由RT反应和PCR反应构成。将病毒核酸连接到PMD18-T载体,提取质粒后,以10倍进行倍比稀释,取每个稀释度的病毒核酸进行mPCR反应,对CSFV、PRRSV的最低检测量分别为8.5pg、8.3×10-2pg。以PCV2、PCV1、PPV、PRV、SIV、E.coil和双蒸水为模板进行mPCR反应,扩增结果均为阴性,表明该mPCR具有较好的特异性。对临床样品的检测表明,本研究建立的mPCR诊断方法能够对CSFV和PRRSV进行快速的诊断,同时对CSFV、PRRSV在猪群中的流行病学调查也具有十分重要的意义。     

鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析

从患传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)病的鳜体内获得ORF093基因。采用PCR方法扩增ISKNV ORF093基因全长,克隆入原核表达载体pET32a(+),IPTG诱导表达,Ni柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备兔抗重组093蛋白血清,免疫印记分析兔抗血清的特异性,中和实验和免疫保护实验分析重组093蛋白的免疫原性。结果显示:ISKNV重组093蛋白可以在大肠杆菌中以包涵体形式存在;制备的兔抗血清可以特异性识别重组093蛋白,对ISKNV具有中和作用,可给鱼体提供至少10 d的100%预防保护;重组093蛋白对ISKNV的攻击具有保护作用,攻毒后15 d,093免疫组平均相对保护率为45.3%。结果说明重组093蛋白具有一定的免疫原性,可作为ISKNV候选疫苗抗原和治疗血清制备抗原。本研究通过中和实验及免疫保护实验对重组093蛋白的免疫原性进行分析,旨在为鳜ISKNV重组亚单位疫苗的研制奠定基础。     

鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4基因的克隆、表达与免疫学检测方法

根据鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus Ⅱ,Cy HV-2)ORF 4基因序列(Gen Bank:JQ815364.1)设计特异性引物,PCR扩增得到ORF 4基因编码框全长序列1 041 bp,将其克隆至原核表达载体p ET-32a(+)中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-ORF 4。将p ET-32a-ORF 4重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导得到融合表达的重组蛋白,融合表达的重组蛋白主要以包涵体的形式存在,其分子质量约为57 ku,与预期大小一致。将纯化的重组蛋白免疫日本大耳兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000,Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接免疫荧光检测结果表明:该多克隆抗体可与由Cy HV-2感染引起细胞病变的异育银鲫脑组织细胞(GICB)发生特异性的结合。     

2017年中国部分地区白斑综合征病毒高变异区的序列分析

白斑综合征病毒(WSSV)自暴发以来给全球范围内的对虾养殖产业带来了巨大的损失。为了解我国凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖区WSSV的流行变异情况,选取2017年中国部分地区的42个WSSV阳性样本,对ORF14/15、ORF23/24、ORF75、ORF94和ORF125共5个可变区进行PCR特异性扩增,分析其序列的缺失变异和重复单元(Ru)中单核苷酸多态性的变化。研究结果显示,在ORF14/15的扩增中共出现4种缺失片段;ORF23/24只出现11945bp的缺失片段;ORF75扩增中,总RUs数目为3、4、9,其中45bp的RUs在12、27、80位点发生多核苷酸多态性;ORF94的RUs数目为6,其各重复单元在48位发生单核苷酸多态性;ORF125的RUs数目为4、6、7不等,其各重复单元分别在20、27、50、53、61位发生碱基突变。研究结果表明,2017年样本中,WSSV在中国大部分地区均出现一定程度的缺失变异,其中部分可变区表现出缺失情况的稳定性,某些可变区的重复单元数目及SNP表现出地区的差异性以及不稳定性。     

坛紫菜核糖体蛋白S7基因的克隆与表达分析

为了研究坛紫菜在高温胁迫条件下的分子应答机制,应用引物退火控制(ACP)技术对耐高温型纯系(Z-61)叶状体在高温胁迫条件下的差异表达基因进行筛选时,获得了一条核糖体蛋白S7基因的全长序列,命名为Phrps7(GenBank登录号:JF719273).该基因序列全长702 bp,包含一个585 bp的开放阅读框,其编码195个氨基酸的核糖体S7蛋白( PhRPS7),蛋白分子式为C984H1604N294O283S2,由5条α螺旋,6个片层及6个环状连接组成,与多个物种的RPS7蛋白具有较高的序列一致性(＞55％).系统进化树分析表明,PhRPS7蛋白与真菌的亲缘关系较近,而与其它物种的亲缘关系较远.实时荧光定量PCR分析结果表明,Phrps7基因的表达水平与高温胁迫密切相关,在高温胁迫刚开始时(0 ～6d),Phrps7基因的表达水平极显著上调,而随着胁迫的继续(＞6 d),表达量又有所下调,但仍显著高于胁迫开始前.     

翘嘴红鲌PEPCK基因的克隆和序列分析

采用RT-PCR和RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法,分离和克隆翘嘴红鲌（Erythroculter ilishaeformis）磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）基因的全序列,得到2 564bp[不含poly（A）]的全长cDNA,包括111bp5′非翻译区,1 911 bp阅读框以及含Poly（A）信号AATAAA的542 bp3＇非翻译区[不包括Poly（A）].阅读框共编码636个氨基酸,计算的分子量为69.65 kD.该序列含有PEPCK特有的结合草酰乙酯的结构域以及与GTP三磷酸链和Mg^2＋结合的激酶1和2基序.与其他鱼PEPCK的相似性高达83%～96%,和爪蟾、变形虫等其他动物的相似性为50%～69%.[中国水产科学,2006,13（3）：389 396]     

湖北地区克氏原螯虾白斑综合征病毒变异区ORF14/15、ORF23/24基因序列比较分析

试验扩增、克隆了在湖北地区采集的19份克氏原螯虾(Procambarus clarkii)白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)阳性样品的变异区ORF14/15和ORF23/24基因,通过测序比较分析了湖北各WSSV毒株与Gen Bank公布的标准毒株间在变异区ORF14/15及ORF23/24基因的差异性。结果显示,19份WSSV阳性样品中有部分样品在变异区扩增出ORF14/15、ORF23/24基因片段,变异区基因序列分析发现,与Gen Bank已公布的标准毒株相比,存在大片段缺失。在变异区ORF14/15,有3个毒株扩增出1 442 bp的片段,4个毒株扩增出630 bp的片段,基于变异区ORF14/15构建的系统进化树显示,这些毒株归属两个不同的分支。在变异区ORF23/24,有2个毒株扩增出大小为2 096 bp的片段,进化分析发现这2个毒株在变异区ORF23/24的遗传距离较近。     

锦鲤疱疹病毒CJ株ORF27基因克隆及生物信息学分析

为了解锦鲤疱疹病毒中国吉林株（KHV-CJ）ORF27基因编码蛋白的结构特征和进化关系,采用镜鲤尾鳍原代细胞增殖KHV-CJ,提取其DNA,经PCR扩增,获得ORF27基因,将其克隆在pMD18-T载体中,构建重组质粒。应用生物信息学方法初步分析KHV-CJ ORF27基因的结构和功能,并与GenBank上公布的三株KHV构建系统进化树。结果显示：获得207bp的ORF27基因,编码69个氨基酸;预测ORF27编码蛋白的理论分子质量为7366.62Da,等电点为4.487;抗原表位预测显示抗原性良好;编码蛋白存在1个N-糖基化位点、4个O糖基化位点和5个磷酸化位点;系统进化树分析表明与锦鲤疱疹病毒美国株（KHV-U）属同一分支。     

锦鲤疱疹病毒ORF72基因克隆及结构功能分析

于辽宁丹东采集感染锦鲤疱疹病毒的活鲤Cyprinus carpio样品,经DNA提取、PCR扩增、重组质粒构建步骤成功克隆锦鲤疱疹病毒ORF72基因,并利用生物信息学软件分析ORF72蛋白结构与功能,构建系统进化树。结果显示:ORF72基因开放阅读框共1113bp,编码蛋白由370个氨基酸组成,理论相对分子质量为40.5KD;ORF72蛋白主要由α螺旋、β折叠、无规则卷曲3种二级结构组成;N端35个氨基酸序列为信号肽序列。跨膜结构分析表明:ORF72蛋白无跨膜区,保守结构域预测表明ORF72含有一个保守结构域,抗原表位分析表明,抗原性较好。结构预测显示:ORF72氨基酸序列存在2个潜在的N-糖基化位点、1个潜在的O-糖基化位点、19个潜在的磷酸化位点。系统进化树分析发现,其与锦鲤疱疹病毒美国株、以色列株属同一分支。     

大菱鲆T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)基因全长cDNA的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)从大菱鲆(Scophthalmus maximus)脾脏cDNA文库中克隆得到T淋巴细胞酪氨酸激酶(LCK)全长cDNA序列.该序列包含193 bp的5'末端非编码区(5'UTR),1 506 bp的开放阅读框(ORF)和300 bp 3'UTR,整个开放阅读框编码502个氨基酸.系统发生分析表明,大菱鲆LCK基因与红鳍东方纯(Fugu rubripes)和黑青斑河纯(Tetraodon nigroviridis)的亲缘关系最近.在大菱鲆正常组织、胚胎细胞(TEC)和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染的免疫器官组织中对LCK基因进行了RT-PCR表达分析.结果表明,大菱鲆LCK基因只在正常脾脏组织中表达;在用鳗弧菌感染12 h后,大菱鲆胚胎细胞LCK基因表达增强;在鳗弧菌感染的大菱鲆免疫组织中,只在脾脏中检测到LCK基因表达,鳗弧菌感染48 h后,LCK基因在脾脏中表达最强.这些结果表明,LCK基因在大菱鲆脾脏免疫应答中起着重要作用.     

鳡肌肉生长抑制素(MSTN)基因的克隆及其组织特异性表达分析

以鳡肌肉总RNA为模板,采用RTPCR和RACE的方法,获得了鳡肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的3个重叠片段,测序后拼接得到2 177 bp全长cDNA序列,其包含了5′端非翻译区的89个核苷酸和3′端非翻译区1 052个核苷酸以及1 125个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸,其中前22个氨基酸为鳡MSTN的信号肽。鳡MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和在C端生物活性区含9个保守的半胱氨酸残基。核苷酸和氨基酸同源性分析发现鳡MSTN与厚颌鲂、草鱼和鲤等鲤形目鱼类的同源性较高,与鲈形目的同源性较低,与哺乳动物和鸟类的同源性最低;系统发育分析表明鳡MSTN与厚颌鲂亲缘关系最近。 半定量RT-PCR分析表明,该基因在肌肉和脑中表达量最高,在心肌中也有较高表达,在肝脏、肠、鳃和肾等组织中未见明显表达,此结果表明鳡MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,可能还有其他功能。     

三疣梭子蟹蜕皮激素受体EcR基因的cDNA克隆及表达分析

通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,EcR基因的表达量在24h后显著低于对照组(P0.05),总体呈下降趋势;低盐(11)胁迫条件下,EcR转录组的表达量呈现先降低后上升的趋势,在12h达到最低,之后逐渐上升,在48h之后显著高于对照组(P0.05)。     

三疣梭子蟹细胞Cdk7基因克隆及其在卵巢发育中的表达

本实验应用RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)周期蛋白依赖性激酶7(Cdk7)基因c DNA序列全长。基因5′和3′非编码区域(UTR)以及开放阅读框的长度分别是23 bp、178 bp和1056 bp,预测编码一个含有351个氨基酸,分子量为39.91 k D的蛋白质,包含一个丝氨酸/苏氨酸催化保守结构域和T-loop结构。同源性分析表明,三疣梭子蟹CDK7氨基酸序列与其他物种Cdk7相似度较高,说明Cdk7基因具有很好的保守性。实时荧光定量PCR结果显示,三疣梭子蟹Cdk7基因在卵巢组织中的表达量显著高于其他组织(P0.05)。Cdk7基因在卵巢发育不同时期的表达量存在差异,其在I期和Ⅱ期的表达量显著高于其他时期(P0.05)。去除眼柄后该基因在卵巢组织中的表达呈现先升高后降低的趋势,并于第4天达到最大值。本研究的结果表明,Cdk7基因参与了三疣梭子蟹卵巢发育调控,为深入开展三疣梭子蟹和其他甲壳动物性腺发育调控机理研究提供了重要信息。