利用SMART技术构建荔枝果皮cDNA文库

以新采收荔枝果实的果皮为材料,利用SMART技术构建荔枝果皮cDNA文库。结果表明,初级噬菌体文库滴度为1.1×10^6pfu/mL,重组率为88.1%,文库的插入片段平均长度约为850bp;扩增文库滴度为2.6×10^9pfu/mL。对2444个克隆进行了测序,获得表达序列标签（EST）2136条,平均测序长度562bp。这些EST拼接成为836个簇,含单一序列549条,重叠群287个。初级文库的冗余度为60.8%。     

感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础.     

花生种子全长cDNA文库的构建和鉴定

以花生品种闽花5号各发育时期的种子为材料分离mRNA,利用SMART技术合成双链cDNA。利用限制性内切酶SfiⅠ酶切。将经过分级分离得到的cDNA连接到质粒载体pDNR-LIB,成功构建花生种子全长cDNA文库。将所得到初级文库扩增后进行保存,检测扩增文库滴度为1.7×109cfu/mL。PCR鉴定重组子,发现重组率接近100%,插入片段集中分布在0.5~2.0 kb。插入片段的平均大小在1000 bp左右,这说明该文库既可以满足低丰度基因的筛选,也可保证获得全长cDNA。     

低温诱导东乡野生稻幼苗期叶片cDNA文库的构建和鉴定

从8℃低温诱导的东乡野生稻幼叶中提取总RNA,以总RNA为模板,利用SMART技术合成第1链,再经LD-PCR扩增合成第2链后,将获得的双链cDNA与双元表达载体YPL3连接,重组质粒电转入大肠杆菌,成功构建了东乡野生稻cDNA文库。经测定,原始文库滴度平均为4.4×107cfu/mL,平均插入片段约1kb,重组率为100%,符合cDNA文库构建要求,为后续利用酵母功能互补技术筛选东乡野生稻有利基因奠定了基础。     

茶树新梢cDNA文库的构建和ESTs测序成功率初步分析

报道了国内第一个茶树cDNA文库的构建及其EST测序成功率分析。以Trizol一步法从龙井43春茶新梢中提取总RNA,分离纯化富含Poly (A)的mRNA,LD-PCR反转录合成双链cDNA,以λTripEX2为载体,构建了龙井43新梢cDNA文库。以XL1-Blue为受体菌测定原始文库的滴度为6.8×10⁵ pfu/ml,总克隆数为3.5×10⁵个,重组率为98.05%,扩增后文库总滴度为7.2×10⁹ pfu/ml。对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定,表明插入片段大多分布在0.5-2.0 kb之间,绝大部分在1.0-1.5 kb左右。文库质量鉴定结果表明,构建的茶树新梢cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。对4320个克隆的序列测定表明,获得有用序列2963个,测序成功率为68.5%,剔除短序列后,首批共获得1687个茶树ESTs。     

海南蒟cDNA文库的构建及评价

全长cDNA文库构建是改良胡椒性状的分子机理研究基础,有助于重要相关基因的克隆、功能分析、调控及其利用.以性状优良并具代表性的海南蒟(Piper hainanense)为试材,采用优化的In-Fusion SMARTerTM Directional cDNA Library Construction Kit技术,构建叶片材料的全长cDNA文库.结果表明:文库的滴度为2.0×106 cfu/mL,文库容量为1.3×106 cfu.从文库中随机挑取20个克隆进行质粒DNA提取、PCR及酶切鉴定,结果显示:插入片段大小为1.0～2.0 kb,重组率为100％,表明该文库质量较高,可满足后续研究需要.     

木奈褐变果实均一化全长cDNA文库的构建及部分ESTs序列分析

以发生褐变初期的(木奈)果肉总RNA为材料,对SMARTTM cDNA合成方法进行改良,并将长距离PCR、DSN处理和定向克隆相结合,成功构建(木奈)褐变果实均一化全长cDNA文库.经检测,该文库的初始滴度为2.0×106 pfu/mL,重组率为99％,插入片段大小平均为1.8 kb,文库质量良好.随机挑取720个阳性克隆进行5'EST测序,共获得684条有效的ESTs序列；并将684条有效序列拼接后,58条被组装成21个重叠群(contigs),单拷贝(singlets)基因有626条,共得到647个单基因簇(unigenes),文库冗余率为8.4％.用Blast 2 go在线软件对测序结果进行功能注释和归类分析,结果显示,已知功能基因与能量代谢、蛋白质合成与降解、次生代谢物质、细胞壁代谢和转录因子有关.该文库的构建有利于从分子水平上研究(木奈)果实褐变发生的机制.     

接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库的构建与分析

利用Trizol法提取接种PRsv 4 d的番木瓜种苗总RNA,分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,双链cDNA末端经Pfu-DNA聚合酶补平,与EcoR I接头连接,XhoI酶切消化产生粘端.用Sepharose CL-2B柱分离纯化去除小分子cDNA片段,再与pMyr酵母表达载体连接,转化受体菌XL10-Gold,构建了接种PRSV番木瓜种苗胞质酵母双杂交cDNA文库.所获得的原始文库的克隆总数为1.8×106cfu,重组率为100%,文库滴度为2.6×109cfu/mL.对随机选取的34个克隆进行PCR鉴定,结果表明插入片段长度均大于O.5 kb且集中在1 kb左右.文库质量鉴定结果表明,该文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段.     

甘蓝型油菜全基因组cDNA FOX-hunting过表达文库构建

为系统解析甘蓝型油菜基因功能,结合FOX-hunting和Gateway重组技术,以4种激素和4种非生物胁迫处理的甘蓝型油菜幼苗根和叶片及成熟期种子和角果全长cDNA为混样,构建了全长cDNA FOX-hunting过表达文库。经检测,初级文库滴度为3.0×106,库容为1.2×107CFU;次级FOX-hunting过表达文库滴度为2.6×106,库容为1.04×107CFU。次级文库菌液PCR鉴定表明,阳性克隆率为96%,扩增均为250～3000 bp随机分布的单一条带,表明初级文库已较好地重组到pJVC55载体上。农杆菌转化后的克隆测序发现,140个克隆中有12个克隆为非特异扩增。GO富集分析发现剩余128个基因中,除21个基因功能富集于光合作用途径外,其余基因在转录因子和激酶中随机分布,且功能涉及器官发育、物质代谢和胁迫响应等多个方面。上述结果表明,本研究构建的甘蓝型油菜FOX-hunting过表达文库无功能偏向性、多态性丰富、完整性高,可作为油菜功能基因组的研究基础。     

剑麻酵母双杂交cDNA表达文库的构建及与AhKNOX2相互作用蛋白的筛选

植物KNOX（Knotted1-like homeobox）可通过蛋白质相互作用参与调控落果、纤维细胞发育、次生细胞壁发育、开花等事件。为筛选剑麻叶中与AhKNOX2相互作用的蛋白,采用SMART同源重组技术构建剑麻叶片酵母双杂交表达文库,利用AhKNOX2为诱饵筛选与之相互作用的蛋白。结果表明：文库总容量为3.9×10⁶ CFU,转化效率为9.15×10⁵ CFU/μg pGADT7-Rec,插入片段大小主要分布于0.5~3.0 kb之间,重组率为92%,保存的文库细胞密度为1.35×10⁸/mL,文库滴度为2.22×10⁷CFU/mL。构建的pGBKT7-AhKNOX2诱饵载体存在自激活性,5 mmol/L的3-氨基- 1,2,4-三唑（3-Amino-1,2,4-triazole,3-AT）能抑制诱饵载体的自激活,通过筛选获得了16个与AhKNOX2相互作用的蛋白。本研究成功构建剑麻叶片酵母表达文库,并筛选获得与AhKNOX2相互作用的蛋白,该结果为进一步研究AhKNOX2在剑麻中的功能奠定前期基础,为培育高纤维产量的剑麻新品种提供基因资源和理论基础。     

壮芽灵浸种对德香4103直播群体结构和产量的影响

大田直播条件下,研究了壮芽灵浸种对三系杂交水稻德香4103群体结构和产量的影响。结果表明：（1）壮芽灵浸种可以显著提高稻种的发芽势,但发芽率提高不显著;（2）壮芽灵浸种可以缩短从始苗到全苗的时间2 d,在播种量相同的条件下,基本苗和出苗率得到显著提高,基本苗从56.67万株/hm^2提高到68.89万株/hm^2,出苗率从75％提高到91％;（3）壮芽灵浸种可以显著提高群体最高苗数和成穗率,最高苗从573.33万/hm^2提高到612.22万/hm^2,成穗率从44％提高到47％;（4）壮芽灵浸种后有效穗数、结实率、千粒重显著提高,增产达7.70％。     

离子注入对花生的生物学效应

取山东烟台选育的鲁花10号花生（Arachishypogaea L．）种子,用离子注入机分别注入0（即对照组）、1×10^12 Cu、1×10^11 Cu、4×10^11 P、9×10^11 P。结果发现,注入9×10^11 P的花生,其植株的叶片数目、开花数目等均优于其他组;注入1×10^12 Cu的花生,单株结实数、百粒湿重、单株产量等最优;聚丙烯酰胺凝胶电泳对幼苗叶片进行的酯酶同工酶分析表明,注入1×10^11 Cu、9×10^11 P、4×10^11P的花生幼苗的酯酶活性增大。综合分析的结果显示,以9×10^11P和1×10^11Cu组所诱导产生的优良生物学性状较多,可以进一步对其进行选育。     

小粒野生稻酵母双杂交cDNA文库的构建

采用酵母双杂交系统,利用SMART技术,在酵母菌株AH109中构建了小粒野生稻全长cDNA文库,文库容量约为1×106,插入片段平均大小约为640bp。该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选。     

巴西橡胶树低温诱导全长cDNA文库构建

通过低温诱导处理巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)品系93-114幼嫩枝条和树叶,提取总RNA,并分离纯化mRNA.利用SMART技术合成橡胶树全长cDNA,经过Sfi I酶切后连接到pDNR-LIB载体中,得到全长cDNA文库.文库库容为1.4×106,重组率达到100%.挑取单菌落提取质粒并酶切鉴定,插入片断分布在0.3～2 kb之间,平均大小为1 kb左右,表明该文库质量合格,可用于全长基因的筛选.     

用酵母双杂交筛选与小麦黄花叶病毒CP互作的寄主因子

为筛选与小麦黄花叶病毒外壳蛋白(wheat yellow mosaic virus coat protein,WYMV-CP)互作的小麦蛋白,构建了小麦茎叶酵母双杂交cDNA文库,并从中筛选获得了与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段。从小麦茎叶中提取小麦总RNA,分离mRNA后,利用GATE-WAY技术将反转录得到的小麦cDNA片段定向转移到目的载体,同源重组反应后成功构建小麦cDNA文库。经检测,小麦cDNA文库的滴度为5.86×106 CFU·mL-1,库容量为2.34×107 CFU,重组率为95.8%。根据NCBI上WYMV-CP开放阅读框信息,构建了诱饵载体pGBK-CP,通过酵母双杂交筛选获得了若干阳性克隆,共转化试验初步验证了WYMV-CP与PEPCK、PAL等蛋白的互作关系。本研究利用酵母双杂交技术成功获得与WYMV-CP互作的小麦蛋白基因片段,为明确WYMV的致病机制提供了科学的依据。