甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶基因ace-3全长cDNA的克隆和序列分析

利用RT- PCR结合RACE技术克隆了甘薯茎线虫（Ditylenchus destructor）乙酰胆碱酯酶基因cDNA,Dd-ace-3,提交GenBank登录号EF583057。该cDNA序列5’端存在反式剪接引导序列SL1,全长2517bp ,包含一个1836bp的开放阅读框;在推导出的611个氨基酸残基的前体蛋白中, N 端的前21个氨基酸残基为信号肽, C-28的位置存在糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点,除此之外的562个氨基酸残基是成熟的乙酰胆碱酯酶序列,其预测的分子量为64396.81D。在一级结构中,形成催化活性中心的3个氨基酸残基 (Ser232 ,Glu360 和His479) ,以及在亚基内形成二硫键的6个半胱氨酸完全保守;在电鳐乙酰胆碱酯酶分子的催化功能域中存在14个保守的芳香族氨基酸残基,其中11个在甘薯茎线虫乙酰胆碱酯酶中完全保守。该酶的氨基酸序列与秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）ACE-3和ACE-4的同源性达56.1%和50.0%。与其它线虫和物种乙酰胆碱酯酶的聚类分析显示,甘薯茎线虫的乙酰胆碱酯酶与Ш型乙酰胆碱酯酶ACE-3同属一个支系。     

桃叶片伤诱导ACC氧化酶基因cDNA的克隆,序列分析其在大肠杆？…

以桃ＡＣＣ氧化酶基因和ＤＮＡ为探针,与伤处理诱导后桃叶片总ＲＮＡ进行点杂交,结果表明,未经伤处理的样品示能检测杂杂交信号,伤处理后２－４ｈ左右信号达到最强,将其样品ｍＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ,通过反转录聚合酶链式反应得到一条０．９５ｋｂ的特异性扩增产物,该扩增产物能与桃ＡＣＣ氧化酶基因组探针杂交。     

猪CD8α全长cDNA克隆与序列分析

应用RT-PCR和RACE技术从猪胸腺细胞总RNA中扩增克隆了猪CD8α的全长cDNA基因。序列分析结果表明，CD8α全长cDNA序列为2179nt（GenBank收录号AY517855）。711nt的开放阅读框编码236个氨基酸残基的猪CD8α前体蛋白（含1个N-糖基化位点）推导氨基酸序列分析显示，存猪CD8α分子的胞外区，7个保守性Cys残基（Cys^46、Cys^57、Cys^118、Cys^167、Cys^216、Cys^218和Cys^182）与猪CD8α分了胞外区免疫球蛋白样结构以及αβ异源二聚体或αα同源二聚体的形成有关。在猪CD8α分子胞浆区，存存与CTL活化信号转导相关的Src家族蛋白酪氨酸激酶p56^kk识别基序CKCP。氨基酸序列比较结果表明，猪与人、牛、鼠、狗和猫CD8α蛋h的氯基酸同源性分别为55．7％、57．6％、35．6％、56．8％和56．4％。     

小白鼠乳铁蛋白基因cDNA克隆及序列分析

乳铁蛋白(LF)是哺乳动物母乳中含量丰富的一种天然铁结合蛋白，广泛分布于具有分泌功能的组织及其分泌物中。许多研究表明，LF可以抵御细菌病毒的侵染并调节机体免疫功能，成为母畜乳腺和仔畜胃肠道的一种防御屏障；能够促进肠道细胞对铁离子的吸收和利用；另外还有关于LF可以抗氧化和促进肠道有益菌群生长的报道。     

中国人白细胞介素-12 (hIL-12)cDNA克隆及序列分析

根据已发表的IL-12两个亚基P35 cDNA序列（NM-000882）与P40 cDNA序列（NM-002187）设计2对引物。以LPS刺激的人脐血淋巴细胞为材料，采用RT-PCR技术从总RNA扩增hIL-12基因，包括完整的前体蛋白编码序列。所得到的序列与GenBank中发表的一致，但与CLMF和NKSF序列有所差异。P35同CLMF相比，244aa密码子GAC（Asp）→GAT（Asp）、247aa密码子ACG（Thr）→ATG（Met）；与NKSF比较，44aa密码子GTC（Val）→GTG（Val）。P40同NKSF比较239aa密码子AAC（Asn）→AAG（Lys），291aa密码子ACC（Thr）→ACG（Thr）；P40同CLMF相比较，氨基酸与核苷酸序列完全一致。通过与不同物种氨基酸及核苷酸序列比较分析，P40亚基与其它动物的同源性80％以上，P35亚基与其它动物同源性在70％。     

莲藕多酚氧化酶基因(PPO)的克隆与表达分析

为获得莲藕中多酚氧化酶(Ppo)基因序列信息及其表达情况,运用PACE技术从莲藕(Nelumbonucifera Gaertn.ssp.nucifera)茎尖中克隆到多酚氧化酶基因全长序列,其cDNA全长2 074 bp,完整的编码框为1 503 bp,编码501个氨基酸,5’端有160 bp非编码区,3’端有411bp非编码区(GenBank登陆号为HQ380894).采用生物信息学方法发现该蛋白分子量约为56.8 kD,pI为8.60,具典型的酪氨酸家族结构域,无信号肽结构,但有跨膜螺旋的亲水性蛋白,a-螺旋和β-折叠分散于整个多肽链中.半定量RT-PCR结果显示,该基因在莲藕茎尖、幼叶、莲藕鲜切片、花瓣、茎杆5种组织中均有表达.方差分析表明,茎尖中PPO表达量与幼叶差异不显著,但显著高于其余三个部位;幼叶中表达量与莲藕鲜切片之间差异不显著,但显著高于花瓣和茎杆;花瓣和茎杆中PPO表达量最低,两者无显著差异.上述结果说明作为重要分生组织的莲藕茎尖产生的PPO可能不具活性或极不稳定,随着植株的生长发育被分配到各组织中,在特定时空下被激活并担负相应的职责功能.     

山羊促卵泡激素α和β亚单位cDNA的克隆与序列分析

促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)是由动物脑垂体前叶分泌的一种糖蛋白类促性腺激素,由α和β两个糖基化亚单位以非共价键连接而成[1,2].使用常规设备和生化方法很难将其分离纯化,在现有的FSH制品中多混杂有上述结构相似的激素,使得FSH作用机理和应用研究受到限制.     

小菜蛾类钙粘蛋白cDNA片段的克隆和序列分析

鳞翅目昆虫中肠刷状缘膜囊泡（brush border membrane vesicles，BBMV）有两类能与Cryl毒素结合的受体蛋白，一类是氨基肽酶N（APN），另一类是类钙粘蛋白（cadherin-like protein）。Gahan等（2001）报道了烟芽夜蛾中肠类钙粘蛋白基因失活导致了烟芽夜蛾（Heliothis viresce）对Bt毒素CrylA产生了高抗性，引起了各国科研人员的关注。近年来，先后有多种昆虫类钙粘蛋白基因被克隆和测序（Gahan et al．，2001：Morin et al．，2003）。     

猪5-HT4b受体基因cDNA克隆和序列分析

利用RT—PCR技术克隆了猪5-HT4bR基因的核苷酸序列，并利用生物信息学手段进行了验证。核苷酸序列测定与分析表明，该基因片段全长1209bp且包含一个完整的开放阅读框，编码402个氨基酸。该序列已在GenBank登录（Accession No．AY566638）。序列分析结果表明，该基因与已报道的人、鼠等5种动物5-HT4bR基因具有较高的核酸序列和氨基酸序列同源性，分别为92．56％和93．63％。该基因编码的蛋白具有7次跨膜结构，属于G蛋白偶联受体超家族。     

六种甘蓝自交不亲和雄性决定因子部分cDNA的克隆及序列分析

S-富含半胱氨酸蛋白(SCR)是自交不亲和雄性决定因子,为了比较甘蓝不同S单倍型SCR基因结构和蛋白分子特性,依据mRNA的ployA序列和SCR保守氨基酸序列设计引物,利用巢式PCR技术分别获得了6种甘蓝(Brassica oleracea L.)D3、E1、240、A1、N1和G1的SCR基因的部分cDNA序列,均包含3’UTR。生物信息学分析表明,6条cDNA序列长度分别为319、311、290、288、385和377bp,分别编码1个58、58、58、58、58和55个氨基酸的SCR蛋白,其中D3的SCR与SCR3序列一致,甘蓝E1、240、A1和N1的SCR与SCR7序列一致,而甘蓝G1的SCR为一个新的S单倍型基因。研究表明,不同S单倍型的SCR二级结构和三维结构都有差异,其与S-位点受体激酶(SRK)相互作用的氨基酸在SCR分子表面,富含碱性氨基酸,且SRK-SCR相互作用需要静电荷参与。同时研究还表明,甘蓝自交不亲和性强度多样性,除了SCR和SRK本身作用能力因素以外,还与SCR和SRK分子的数量有关,而SCR的数量是通过3’UTR在mRNA水平调控的。分析表明,SCR的进化速度很快,并且3’UTR的进化速度高于氨基酸编码区的进化速度。本研究为进一步探索和利用自交不亲和机制提供了理论基础。     

人胰腺激肽释放酶cDNA的克隆、序列分析和原核表达

摘要: 为了研制人激肽释放酶（KLK1）特异单克隆抗体和进行重组酶的鉴定及纯化，根据已发表的人KLK1序列设计引物，用PCR扩增法从人胰腺单链cDNA库中特异地扩增出KLK1 cDNA。将其克隆入pGEM-T载体中,对5个重组质粒进行了序列测定，其中1个cDNA克隆的核苷酸序列与已发表的人肾/胰/唾液腺KLK1 cDNAs序列完全相同或有3个核苷酸差异。将去除信号肽序列的KLK1 cDNA以正确阅读框插入表达载体pGEX-4T-3,构建成重组质粒pGEX-KLK1。此重组质粒转化的E.coli 经IPTG诱导后表达分子量为48 kDGST-KLK1融合蛋白，表达产物主要以不溶性包涵体形式存在，可溶性部分能被Glutathione Sepharose 4B特异吸附，两者都能被GST特异单克隆抗体识别。用SDS-PAGE分离纯化的融合蛋白免疫小鼠，获得的抗血清的ELISA效价为1∶1600。结果表明，克隆的人KLK1 cDNA及其表达产物是正确的，可以用于人KLK1单克隆抗体的制备。     

稻瘟病菌发育cDNA文库构建与表达序列标签分析*

利用稻瘟病菌(Magnaporthegriesa)连续6个发育时期的材料构建了一个混合cDNA文库。文库滴度,重组率和插入片段长度等质量分析表明,构建的文库包含完整的稻瘟病菌基因,可用于病菌基因表达分析。利用该文库获得了7456条5′端表达序列标签(ESTs)(GenBank收录号:(CK909944￣CK913666和CK928583￣CK932582),生物信息分析表明:EST序列拼接出2975个假定独立转录本(TUTs),冗余度为60.1%;从cDNA文库中筛选出大量的低丰度表达基因,约占TUT总数的79.8%,说明在文库中基因组成类型的复杂性较高;在所有TUTs中,功能未知基因约占85.5%,编码ECM33蛋白和疏水蛋白等病菌致病相关的注释基因高丰度表达,进一步表明该cDNA文库反映了病菌侵染和发育过程中基因表达的状况。     

欧李叶片全长cDNA文库的构建和部分克隆的序列分析

采用SMART技术,构建了欧李(Prunus humilis Bunge)品系T8-1叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达6.17×10~7 pfu/mL,库容达3.7×10~7,重组率达95%,平均插入片段大小约为1.2 kb.随机挑取400个单克隆进行5'端测序,共获得364个欧李ESTs.绝大部分ESTs的长度在500～1300 bp之间,平均长度为877 bp,其中具有完整ORF结构的序列有221条,占60.71%.通过与NCBI等非冗余核酸数据库和蛋白质数据库进行比对、查询和注释,获得已知功能基因或具推测功能的基因181个(339个ESTs),相似性较低的未鉴定基因5个(9个ESTs),新基因14个(16个ESTs).     

巴西橡胶树磷脂酰肌醇转移蛋白cDNA的克隆及其序列分析

本文从巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）差减cDNA文库中筛选到一个与磷脂酰肌醇转移蛋白（phos-phatidylinositol transfer protein）同源性较高的基因片段,并根据该基因片段序列信息,设计特异性引物,采用cDNA末端快速扩增技术RACE（rapid amplification of cDNA ends）进行差异片段的5＇和3＇端的扩增,并获得长度为1081bp的全长cDNA克隆R291（GenBank登陆号：AY589690）。序列分析表明,该基因包含702bp的开放阅读框,编码234个氨基酸,推测其蛋白质的分子量为26.8kD,等电点为6.51,有一个的跨膜螺旋区（氨基酸位点为83～103）。R291基因含有一个脂质结合保守区（Sec14p-like lipid-binding domain）,具有CRAL-TRIO脂质结合结构域,推测该基因是一个磷脂酰肌醇转移蛋白基因。该基因的克隆将为橡胶树磷脂酰肌醇代谢的研究奠定了基础,将有助于进一步了解磷脂酰肌醇代谢与胶乳再生之间的关系。     

甘薯全粉加工及其挤压膨化食品特性的分析研究

探讨制备高品质甘薯全粉的简便方法，及以甘薯全粉为主要原料，通过挤压膨化技术生产甘薯营养食品的可能性，并对挤压膨化过程中营养成分及理化性质的变化进行了研究分析。结果表明，经挤压膨化后，原料中淀粉、蛋白质含量略有下降，总糖含量上升，吸水性，水溶性指数增大，色泽略有加深，并有浓郁的特征香味产生。     

狂犬病病毒3aG株核蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

从狂犬病病毒感染的ＢＨＫ细胞裂解上清液中快速提取病毒ＲＮＡ,用反转录－聚合式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法得到编码核蛋白完整结构基因的ｃＤＮＡ,进一步将此基因克隆入ｐＵＣ１８中,进行核苷酸序列分析,并与国外ＰＶ、ＣＶＳ、ＳＡＤＢ１９株以及国内５ａＧ株的Ｎ基因序列进行了同源性比较,证明所克隆Ｎ基因正确。