鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究

从鸡源产气荚膜梭菌C57-86中PCR扩增出a毒素基因,构建了表达质粒p GEXKG-a,并进行核苷酸序列进化分析。结果表明,鸡源产气荚膜梭菌的a毒素基因与参考菌株strain AL08-16相似性较高,核苷酸同源性为97.7%。对重组菌株BL21/KG-a诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,重组菌株BL21/KG-a可以高效地表达毒素蛋白质;免疫试验表明,表达产物免疫的SPF试验鸡可抵抗A型产气荚膜梭菌的攻击。     

产气荚膜梭菌青海分离株α毒素基因克隆与表达

用PCR技术,从一株田间分离的产气荚膜梭菌基因组中扩增出了1 194 bp的α毒素基因,经限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切处理后将其连接在经同样内切酶处理的载体pET\|28a(+)中的相应位点上,最后转化至受体菌BL21(DE3)中。经PCR、双酶切和核苷酸序列分析,证明重组质粒pET\|28a\|CPA含有产气荚膜梭菌α毒素基因,再将其转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,目的基因获得了良好表达。以羊抗α毒素多克隆血清进行Western blot分析,抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应,表明目的蛋白具有较好的免疫原性。     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位与产气荚膜梭菌毒素融合蛋白的免疫原性

梭菌毒素作为产气荚膜梭菌的主要致病因子可引起家畜的多种疾病,其中β1毒素和β2毒素是由C型菌产生的2种引起动物坏死性肠炎的主要致病因子。基因工程重组毒素蛋白已作为潜在候选疫苗用于预防该菌所引起的多种传染性疾病,大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)是一种常用的黏膜免疫佐剂。本研究将ltb-cpb2-cpb1及ltb-cpa融合基因进行IPTG的诱导表达,制备了包涵体粗提物,并对小白鼠进行免疫攻毒试验及其免疫后抗原免疫保护期的免疫原性的研究。结果显示,经LTB-CPB2B1及LTB-CPA重组蛋白免疫后的小白鼠在第28、第56天时用产气荚膜梭菌强毒攻击,可获得很好的保护,产气荚膜梭菌毒素与LTB融合基因重组菌株能够有效刺激免疫小白鼠产生特异性抗体。说明该重组菌株可以作为预防产气荚膜梭菌所引起疾病的候选菌株。     

C型产气荚膜梭菌α、β1、β2毒素基因融合及免疫原性研究

为了构建具有良好免疫原性的α-β1-β2融合蛋白,利用PCR技术,从含C型产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆质粒pETXAl中扩增出0.95 kb α毒素基因,将其连接到经Nco I单酶切并用碱性磷酸酶处理的含1.65 kb β1-β2融合基因的重组质粒pETXB1B2上,构建含2.6 kb α-β1-β2融合基因的表达质粒重组菌株BL21(DE3)(pETXAB1B2).经酶切鉴定和序列测定证实.构建的重组质粒pETXAB1B2含有α-β1-β2融合基因,且基因序列和阅读框架正确.经ELISA检测,重组菌株表达的α-β1-β2融合蛋白能够被α、β1和β2毒素抗体识别.表达优化结果表明,以IPTG为诱导荆诱导α-β1-β2融合基因表达的优化条件是:培养基PH 7.5,培养温度37℃,IPTG浓度0.4 mmol.L-1,菌体生长密度OD600达到1.0时加入IPTG,诱导时间5 h,此时α-β1-β2融合蛋白表达量为31.2%.免疫试验结果表明,α-β1-β2融合蛋白免疫的小鼠可以抵抗1MLD(最小致死量,minimum lethal dose)C型产气荚膜梭菌标准株C59-44毒素攻击,表明构建的重组菌株可以作为预防仔猪红痢基因工程亚单位苗的候选菌株.     

表面展示C型产气荚膜梭菌α,β毒素蛋白重组乳酸菌的 构建及反应原性分析

构建表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白的重组乳酸菌,并对表达蛋白反应原性进行鉴定。通过PCR构建pSIP409-pgsA’-α,pSIP409-pgsA’-β1以及pSIP409-pgsA’-β2质粒,并将三种质粒电转入植物乳杆菌NC8后诱导表达,通过Western-blot和间接免疫荧光检测目的蛋白的表达情况。构建的NC8-pSIP409-pgsA’-α,NC8-pSIP409-pgsA’-β1以及NC8-p SIP 409-pgsA’-β2三种重组乳酸菌能成功表达C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白,三种表达的融合蛋白大小分别为61 kDa、52 kDa以及46 kDa。三种重组乳酸菌表达了C型产气荚膜梭菌α,β1和β2毒素蛋白且与制备的多抗具有良好的反应原性,为C型产气荚膜梭菌口服疫苗的研制奠定基础。     

产气荚膜梭菌毒素型菌落多重PCR方法的建立及应用

根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因cpa、cpb、etx、iA设计并合成4对特异性引物,建立快速鉴定产气荚膜梭菌毒素型的多重PCR方法。结果显示:产气荚膜梭菌A、B、C、D和E型参考菌株均扩增出相应的片段,而肉毒梭菌、气肿疽梭菌、腐败梭菌、诺维梭菌的扩增均为阴性;将产气荚膜菌株单个菌落稀释100倍,仍能扩增出相应的目的片段。利用此多重PCR方法对16株不同动物来源的产气荚膜梭菌进行分型鉴定,并与毒素中和试验鉴定结果进行比较,结果显示2种方法具有较高的符合率。该方法可有效进行产气荚膜梭菌的快速检测和分型,对产气荚膜梭菌感染与食品安全问题的研究具有参考价值。     

C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的测定与分析

[目的]研究C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列的遗传变异特点。[方法]设计产气荚膜梭菌α毒素基因特异性引物进行PCR扩增,扩增产物纯化后测定核苷酸序列并与NCBI登录的参考序列通过DNAStar软件进行同源比对。[结果]序列分析表明,所测菌株α毒素基因核苷酸组成中腺苷酸含量较高,胞苷酸含量较低。所测菌株与13、C57-1、CER 89L43、S01、S08、T01以及T16菌株的核苷酸序列同源性分别为98.7%、98.7%、98.6%、98.8%、98.7%、97.0%、98.6%,推导的氨基酸序列同源性分别为98.6%、98.6%、98.9%、98.9%、98.9%、98.6%、98.6%。[结论]所测C型产气荚膜梭菌α毒素基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与参考序列同源性均较高。     

产气荚膜梭菌β2 -β1毒素融合基因在大肠杆菌中高效表达条件的优化

本研究在已获得产气荚膜梭菌β2-β1毒素融合基因表达载体,并在BL21（DE3）中成功表达的基础上,研究了以乳糖为诱导剂在不同条件下对β2-β1。重组蛋白诱导表达的影响,并对其表达条件进行了优化。结果表明,重组菌株BL21（DE3）（pXETB2B1）在37℃、菌体诱导密度OD_600为1．0、乳糖诱导浓度为0．1g／L时诱导5h,目的蛋白的表达效果最好,乳糖则以分批添加的方式为佳。     

无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白的自诱导分泌表达及免疫原性分析

为获得分泌表达的无毒性产气荚膜梭菌α毒素重组蛋白并分析其免疫原性,根据A型产气荚膜梭菌α毒素基因序列,对α毒素的第176位组氨酸突变为天冬酰胺,同时对信号肽序列进行密码子优化,将化学合成的该序列插入到载体pET32a,获得重组质粒pET32a-αH176N,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),通过自诱导的方法分泌表达重组αH176N蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析结果显示,αH176N蛋白在乳糖1～2 g/L、28℃诱导条件下高效分泌表达。卵磷脂酶试验及小鼠毒力试验显示,αH176N蛋白失去磷脂酶C活性及毒性。免疫保护试验结果显示,αH176N蛋白与氢氧化铝胶配制成的疫苗,以0.25 mL/只免疫试验兔就能达到100%(6/6)的免疫保护效果,优于传统灭活疫苗免疫2 mL/只的保护效果。     

不同诱导剂及培养条件对C型产气荚膜梭菌β_2毒素基因表达的影响

对产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)β2毒素基因的表达载体p ETXB2进行限制性核酸内切酶酶切鉴定,并用SDS-PAGE检测了不同培养条件下,该毒素基因在埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)工程菌株中的表达情况。结果表明,p ETXB2重组质粒中的β2毒素基因位于p ET-28c(+)表达盒中,且阅读框架和基因序列正确。以IPTG为诱导剂时,重组菌株BL21(DE3)(p ETXB2)的最佳培养条件为37℃,p H7.0,IPTG终浓度0.8 mmol·L-1,诱导4 h;以乳糖为诱导剂时,其最佳培养条件为37℃,p H 7.0,乳糖终浓度0.5 g·L-1,诱导5 h。     

A型魏氏梭菌α毒素羧基端蛋白基因表达与结构分析

利用PCR技术将α毒素羧基端基因CPA251-370克隆到pET-32a载体上,构建了重组表达质粒pXETCPA-C,酶切鉴定和序列分析证实其含有CPA251-370基因且序列和阅读框架均正确。对重组菌株BL21(DE3)(pXETCPA-C)表达的蛋白质进行SDS-PAGE分析,结果表明CPA251-370蛋白表达量占菌体总蛋白质相对含量的16.43%。SOPMA法预测表明CPA251-370蛋白二级结构主要由β折叠和无规则卷曲组成,其3D结构与α毒素羧基端部分相似。CPA和CPA251-370蛋白的圆二色(CD)光谱分析发现两者的CD光谱仅有一些微小变化。免疫攻毒试验表明CPA251-370蛋白免疫的小鼠能抵抗最小致死剂量(MLD) 0.5 mL·只~(-1)(活菌数约为5×10~9 cfu)的A型魏氏梭菌标准株C57-1毒素攻击。该研究深入阐释了A型魏氏梭菌α毒素的分子结构,为揭示其作用的分子机制奠定了坚实基础。     

B型产气荚膜梭菌三种主要毒素基因的PCR检测

为了对B型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type B)进行快速检测,依据NCBI登录的产气荚膜梭菌α、B及ε毒素基因序列设计引物,并对其进行PCR扩增.琼脂糖凝胶电泳结果显示3个毒素基因均被成功扩增,目标片段条带清晰,长度与预期相符.     

牛产气荚膜梭菌分离株毒素基因的检测与分析

为了解黑龙江省牛源产气荚膜梭菌分离株的基因型,检测β2和CPE两种次要毒素因子在牛源产气荚膜梭菌分离株中的携带情况。通过PCR方法检测了产气荚膜梭菌13个野毒株的cpa、cpb、etx、itx四种分型毒素、cpb2、cpb2的两个等位基因突变体(atypical cpb2和consensus cpb2)及肠毒素(cpe)基因。结果表明:92.3%(12/13)的产气荚膜梭菌分离株为A型,检测到1株D型;A型菌中β2毒素基因检出率为66.7%(8/12);β2毒素基因阳性菌株中75%(6/8)携带非典型cpb2基因,50%(4/8)携带典型cpb2基因,非典型突变体占优势。动物致病性试验发现β2毒素阳性菌株(8株)与β2毒素基因阴性菌株(4株)各有2株分离株具有致病性。所有菌株CPE毒素基因PCR检测均为阴性。研究为产气荚膜梭菌病的发病机理和疫苗开发提供了理论依据。     

无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETX_m2。将GETX_m2克隆至原核表达载体pET30a-(＋)后,将pET30a-GETX_m2转化至BL21（DE3）感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rETX_m2。利用Western blot方法,检测rETX_m2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将rETX_m2用细胞维持液稀释至100及10 μg·mL^-1,检测其对犬肾细胞系（MDCK细胞）的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的rETX_m2,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg^-1 3个剂量尾静脉注射,检测rETX_m2对小鼠的毒力。随后,将rETX_m2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次（间隔两周）,100 μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测rETX_m2对家兔的免疫保护效果。【结果】 在15℃和37℃条件,rETX_m2在BL21（DE3）菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性rETX_m2。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,rETX_m2可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别rETX_m2,出现特异性反应条带。MDCK细胞毒性实验显示,在rETX_m2浓度为100 μg·mL^-1的细胞培养基中孵育24 h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg^-1剂量的rETX_m2,对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,rETX_m2免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450-750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500-4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气荚膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护。【结论】产气荚膜梭菌rETX_m2毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的定点突变与表达

选择可能影响α毒素生物活性的氨基酸相关碱基位点进行定点突变,构建α毒素基因的突变体并在大肠杆菌中表达。利用PCR定点突变技术,进行第68位组氨酸→亮氨酸的定点突变,构建含α毒素突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)。结果表明,α毒素突变基因第287位核苷酸由A→T,经酶切鉴定和序列测定证实,构建的重组质粒pXMCPA02含有α毒素突变基因,且基因序列和阅读框架正确;重组菌株BL21(DE3)pLys(pXMCPA02)表达产物经SDS-PAGE分析,其表达量占菌体总蛋白相对含量的33.82%。因此,已成功构建了α毒素基因突变体,并实现了在重组大肠杆菌中的表达。     

D型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析

研究D型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)青海分离株ε毒素基因的遗传变异特点,试验设计特异性引物扩增ε毒素基因,目的基因片段大小为888 bp.建立PCR反应体系并设置反应条件,扩增产物进行电泳检测、纯化、测定核苷酸序列,与参考序列进行同源比对分析.结果表明,目的基因扩增良好,分离菌株WC-epsilon-FL与菌株C60-3、NCTC 8346、Mukteshwar、AJ250956的核苷酸序列的同源性依次为99.9％、99.8％、98.9％、99.4％.     

C型产气荚膜梭菌不同菌株交叉免疫保护力研究

将C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)C59-2、C59-37和C59-383种菌株分别制备成灭活疫苗,分别免疫小白鼠和家兔,2周后分别用不同菌株的致死性毒素进行攻击。结果表明,C型产气荚膜梭菌不同菌株制备的灭活疫苗免疫小白鼠和家兔后,可使小白鼠和家兔能抵抗其他菌株致死性毒素的攻击,小白鼠保护数在7/8以上,家兔保护数也均在3/4以上。说明C型产气荚膜梭菌不同菌株之间具有较好的交叉免疫保护作用。     

含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素基因的重组大肠杆菌的高密度发酵和免疫效果

为确定含腐败梭菌α毒素和产气荚膜梭菌ε毒素重组蛋白的生产效率并评价其作为抗原的免疫效果,用生物反应器对重组大肠杆菌DE3-pET-AE进行高密度发酵,并将其制苗后以不同抗原剂量分别接种家兔和绵羊,间隔21 d进行二免,分别测定一免、二免动物混合血清的中和效价。发酵结果显示,培养物菌体密度D_(600 nm)达20.3,相对表达量为27.6%,D_(600 nm)与相对表达量的乘积为摇瓶培养的6.5倍,菌体湿质量为37.2 g/L;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,目的蛋白以可溶形式表达。动物免疫效果评价结果显示,在家兔和绵羊上,抗原含量与免疫效果在一定的范围内均呈正相关,当接种量为300μg/只时,免疫效果均最好;对腐败梭菌毒素与D型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价,在家兔上一免、二免分别达4与30、15与200,在绵羊上一免、二免分别达2与30、12与250。结果表明,DE3-pET-AE菌高密度发酵可获得高产量蛋白抗原,且抗原的免疫效果明显优于《中华人民共和国兽药典》合格标准。     

牛产气荚膜梭菌黑龙江分离株的分型鉴定

为了对三株未知型牛源产气荚膜梭菌(Clostridium Perfringens,Cl.perfringens)进行基因分型鉴定,将三株未知型菌株进行厌氧培养、纯化,观察培养特性,进行革兰氏染色镜检以及生化管鉴定,根据产气荚膜梭菌α、β、ε和ι毒素基因以及产气荚膜梭菌16S r RNA保守基因分别合成5对引物,建立PCR方法。经培养特性、革兰氏染色镜检、生化特性以及16S r RNA保守基因细菌PCR鉴定均符合产气荚膜梭菌,PCR结果表明,三株产气荚膜梭菌均为A型。     

冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素的潜在危害分析

为调查广州市冷鲜鸡产气荚膜梭菌及其毒素危害,从广州市各大型超市随机采集鸡肉样品进行产气荚膜梭菌分离、鉴定和毒素分型,同时检测分离菌株对常用抗生素的抗药性,并采用Eric-PCR对分离出梭菌进行亚型分析。结果表明,从78个样本中分离出57株产气荚膜梭菌,所有菌株均为A型,其中,cpb2(Atypical)型40株,cpb2(consensus)型1株;含net B基因菌株1株;药敏结果显示,分离出的产气荚膜梭菌大部分对氟苯尼考、氨苄西林、青霉素敏感;值得注意的是产气荚膜梭菌分离株对仅可用于人的抗生素克林霉素、头孢氨卞的耐药率分别达73.68%和31.58%。Eric-PCR结果显示,相似性为80%时,57株梭菌可分为13个亚型,提示污染来源的多样性。