SRAP标记体系优化及在茶树种质资源研究中的应用

以Me3和Em5正反向引物组合对凤凰水仙茶树品种进行了SRAP分析体系的优化。结果表明：茶树SRAP-PCR最佳反应体系为：Mg2＋浓度3.0 mmol.L-1;Taq酶2.0 U;dNTPs浓度0.2 mmol.L-1;引物浓度2.0μmol.L-1;10×Buffer 2.0μL;模板DNA 20 ng;反应总体积为25μL。经过重复试验,确定茶树SRAP-PCR扩增程序为：94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸100 s,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸100 s,35个循环;最后72℃延伸5 min。采用已优化的体系对30份茶树品种进行SRAP分析,经2%的琼脂糖凝胶电泳得到了清晰且重复性好的扩增谱带,说明该反应体系稳定可靠,适用于茶树种质资源的分子标记分析。     

红花檵木SRAP反应体系的建立及优化

为了获得红花檵木清晰的SRAP标记图谱,对红花檵木DNA的提取方法以及SRAP-PCR反应体系的影响因子进行了初步探讨,筛选和建立了扩增多态性高、重复性好、带型清晰的DNA模板和SRAP-PCR反应体系,同时提出了应用SRAP分子标记构建红花檵木遗传图谱的可行性.最佳SPAR-PCR反应体系为:在50μL的反应体系中,Mg2 1.6 mmol/μL,dNTPs 1.0 mmol/μL,DNA模板150 ng,DNA聚合酶3.6 U,上下引物各0.20 mmol/L.扩增程序为:94℃预变性4 min,反应前5个循环在94℃1 min、35℃1 min、72℃1 min条件下运行,随后的30个循环复性温度提高到55℃,最后72℃延伸5 min.     

鹅掌楸ISSR-PCR反应体系的建立及优化

为建立鹅掌楸简单序列重复区间扩增ISSR的PCR优化反应体系,以鹅掌楸叶片基因组DNA为材料,系统地测试了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR-PCR反应体系的影响。结果表明:优化的PCR反应体系为:20μL总体系中,含30 ng模板DNA,0.3μmol.L-1随机引物,0.2 mmol.L-1dNTPs,1.4 mmol.L-1Mg2+,0.8 UTaqDNA聚合酶;最佳退火温度为60℃;PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,60℃退火45 s,72℃延伸2 min;45个循环;72℃再延伸7 min。     

红花石蒜 ISSR-PCR反应体系的建立

以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.     

润楠ISSR-PCR优化反应体系建立及引物筛选

以润楠基因组总DNA为材料,利用单因素试验设计方法,对影响ISSR-PCR扩增的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Tag DNA聚合酶以及去离子甲酰胺等试验因子进行了优化试验,筛选出16条有效引物并确定了它们的退火温度,并检测了体系的重复性。优化后的反应体系为:20μL PCR反应体积中,10×PCR Buffer 2μL,2.0mmol/L Mg2+1.6μL,0.2 mmol/L dNTPs 2μL,0.4 mmol/L引物0.8μL,0.5U Taq DNA聚合酶0.1μL,40 ng DNA模板1.0μL,1.5%去离子甲酰胺0.3μL,ddH2O 12.2μL。扩增程序为:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,据不同引物的退火温度复性45 s,72℃延伸90 s,反应37个循环,最后在72℃延伸7 min。润楠ISSR-PCR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究润楠的遗传多样性奠定了良好的基础。     

狗牙根ISSR—PCR反应体系的建立与优化

以改良的CTAB法提取的狗牙根叶片DNA为模板,采用单因素多水平方法对狗牙根ISSR反应体系进行构建和优化,系统分析Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物和buffer这6种1SSR反应成分的浓度对扩增结果的影响,结果表明:20.0μL PCR反应体积中,20.0 ng模板DNA,0.4 μmol/L引物,0.5mmol/L Mg2+,0.05mmol/L dNTPs,0.2U TaqDNA聚合酶,2.0 μL 10×buffer.反应程序为;94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55 C退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;再72℃延伸7 min,4℃保温.     

桉树的ISSR反应体系建立及优化

以改进的CTAB法提取桉树嫩叶总DNA,进行ISSR分析,分别测试了退火温度、模板DNA浓度、Mg2 浓度、dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量对反应结果的影响。桉树ISSR-PCR分析较适宜的扩增条件是:25μL PCR反应体积中,buffer(10 mM Tris-HCl,pH9.0,50 mM KCl,0.1%Triton X-100),1.25 U TaqDNA聚合酶,4种dNTPs各0.2 mM,0.4μM引物,2.0mM MgCl2,50 ng模板DNA。最佳扩增程序为:94℃预变性5 min,然后进行45个循环:94℃变性45s,52℃~55℃复性45s,72℃延伸90s,循环结束后72℃延伸7min。     

桉树ISSR-PCR反应体系的建立及优化

模板DNA、引物、dNTPs、Mg^2＋的浓度,Taq DNA聚合酶的用量以及退火温度是影响简单序列重复区间扩增（ISSR-PCR）结果的主要因素.以桉树叶片基因组DNA为试材,系统地测试了这6个因素对桉树ISSR反应结果的影响.结果表明：最优化的反应体系即20μL反应体系中,含20 ng模板DNA、0.4μmol.L^-1随机引物、0.15 mmol.L^-1dNTPs、2.0 mmol.L^-1Mg^2＋、1.25 U TaqDNA聚合酶.最佳退火温度为55℃;PCR反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1.5 min,35个循环;72℃再延伸7 min.     

柳叶蜡梅RAPD反应体系的研究

以柳叶蜡梅（Chimonanthus Salicfiolius Hu）为材料,对其DNA提取方法和PCR扩增反应体系的建立和优化进行探讨。最适宜的PCR反应条件为：20μL PCR反应体积中含有1×缓冲液,20 ng模板DNA,2.75 mmol/LMgCl2,0.25 mmol/L dNTPs,2.0 U Taq DNA聚合酶,0.4μmol/L引物。扩增程序为：94℃预变性2 min;再32个循环：94℃60 s,36℃30 s和72℃120 s;最后72℃延伸10 min。     

桢楠DNA提取和RAPD条件的优化

以桢楠（Phoebe zhennan）新鲜叶片、硅胶干燥叶片为材料,研究了DNA的提取方法,并对影响RAPD反应的各因素进行了优化。得到了桢楠RAPD的优化反应体系及程序,适合桢楠RAPD反应的体系总体积为25μL,DNA模板2μL,Taq DNA聚合酶用量0.3μL,引物用量1μL,Mg2＋用量5μL,dNTPs用量0.5μL,ddH2O16.2μL;适合桢楠RAPD扩增的程序是94℃预变性3 min,94℃变性1min,36℃复性1 min,72℃延伸2 min,42个循环,最后72℃延伸10 min,产物于4℃保存,同时结果表明硅胶保存的样品完全可以与传统的新鲜叶片得到同样的PCR扩增结果,完全可以满足研究需要。