进境木质包装中伞滑刃属线虫疫情分析

2003年1月至2006年6月，宁波口岸共检测进境木质包装8720批次，其中1772批次检出各种活线虫，疫情检出率高达20．3％。根据形态学特征和ITS—RFLP图谱鉴定伞滑刃属线虫19种（其中4种被鉴定为新种，1种尚未发表）342批次，占总检测批次的3．9％。不仅从疫区也从多个非疫区国家进境木质包装中检出松材线虫。     

进境木质包装中豆伞滑刃线虫的鉴定

豆伞滑刃线虫由宁波出入境检验检疫局植检室验室于2004年6月首次从台湾的针叶木质包装中截获并报道以来,至今共截获17批次,分别来自韩国（6批次）、中国台湾（4批次）,日本（4批次）,印度（1批次）,马来西亚（1批次）和南非（1批次）.该线虫属松材线虫组,与拟松材线虫、松材线虫等十分接近.其主要鉴定特征是：雌虫尾圆锥形略向腹面弯曲,其腹面的边线较平直,而背面的边线明显呈圆弧形;尾尖长约2～4μm,渐细,有时呈丝状,位于腹面;雄虫交合刺较大（约36～40μm）,中间部分几乎呈直线.该线虫很容易与拟松材线虫等混淆,当形态学鉴定有困难时,ITS-RFLP方法是十分有效的辅助手段.我国大陆尚未有该线虫发生的报道.     

无锡口岸进境木质包装中截获的两种伞滑刃线虫的形态鉴定

松材线虫病是林业上的一种毁灭性病害.在进境木质包装检疫中,除该病的病原物松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus(steiner et buhrer)Nickel)外,还常常截获同属于伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus spp.)的多种与之形态非常相似的线虫.本研究对进境木质包装检疫中截获的两种伞滑刃属线虫--B. rainulfi和B.conicaudatus进行了形态描述和鉴定.     

食菌伞滑刃线虫和阿苏里伞滑刃线虫的比较鉴定

宁波口岸在进境木质包装检疫中经常截获食菌伞滑刃线虫和阿苏里伞滑刃线虫,这2种线虫都属于fungivorus组,形态上十分近似。主要区别在于:前者唇区缢缩十分明显,而后者缢缩不明显;前者排泄孔与半月体平均距离较远(约11μm),而后者较近(约5μm);前者雄虫热杀死后尾部强烈向腹面弯曲(超过180°),后者尾部略腹弯(约90°);前者基顶与喙突相距约9.8μm,喙突高约2.7～3.5μm,后者则分别为8.4μm和1.5～2.8μm;前者雌虫尾多数腹弯十分明显,尾较短(长约50μm),后者尾一般略腹弯(长约68μm)。此外,ITS区的PCR-RFLP方法可区分上述2种线虫。     

俄罗斯木质包装中杨树伞滑刃线虫的鉴定

宁波口岸从来自俄罗斯的杨树木质包装中截获一种伞滑刃线虫,经形态学和分子生物学研究,鉴定为杨树伞滑刃线虫。该线虫与伪伞滑刃线虫十分近似,主要鉴定特征是:阴门盖明显腹弯,近阴门盖后半部的虫体明显凹陷;雄虫交合刺近远端边缘平直,无明显凹陷,远端盘状突十分显著;雌虫尾亚圆柱形或近圆锥形,尾端多数呈多变的尾尖突状,偶尔几乎钝圆。该线虫人工培养后雌虫尾形多数介于圆柱形和圆锥形之间,这与原始文献的报道有差异。这是我国口岸首次截获该线虫。     

日本木质包装中截获的伞滑刃属线虫鉴定

天津局从来自日本的木质包装材料中截获1种松材线虫近似种.通过形态特征观察和形态测量数据比较以及核糖体内部转录间隔区(rDNA-ITS)的PCR-RFLP分析,鉴定该分离物为豆伞滑刃线虫Bursaphelenchus doui.     

宁波检验检疫局多次截获非洲伞滑刃组线虫

2006年来,宁波出入境检验检疫局植检实验室曾多次从进境木质包装中首次截获并报道非洲伞滑刃组（africanus group）线虫,它们分别为非洲伞滑刃线虫（Bursaphelenchus africanus Braasch, Gu, Burgermeister, Brandstetter &; Metge, 2006）、伯氏伞滑刃线虫（B. burgermeisteri Braasch, Gu, &; Brandstetter, 2007）和欧斐切伞滑刃线虫（B. obeche Gu, Braasch, Zhen, Burgermeister &; Lin, 2008）。这些线虫均为作者最先截获。非洲伞滑刃组线虫的主要鉴定特征是：侧线4条;尾乳突7个（第3对和第4对靠近并位于交合伞起始处,第3对略位于第4对前并更靠近腹面）;交合刺较直,中部有横纹,冠状体愈合（基顶和喙突不明显）,远端无盘状突;后阴子宫囊约占肛阴距1 /2。目前尚无关于该组线虫媒介昆虫及致病性的报道。     

2种常见伞滑刃线虫的特异PCR检测方法

包括松材线虫和椰子红环腐线虫在内的伞滑刃属线虫形态上相似性高,形态鉴定难度较大。本文通过对伞滑刃属常见线虫群体ITS2区序列比对、分析,设计了木质包装材料检疫中常见的泰国伞滑刃线虫和豆伞滑刃线虫特异引物对各1对,并研究了这2种常见伞滑刃线虫的PCR检测方法,使用本文特异引物可分别特异、快速检测出这两种线虫。     

韩国入境木质包装箱中阿苏里伞滑刃线虫的鉴定

广东出入境检验检疫局植检实验室于2007年12月自韩国木质包装中截获一种伞滑刃属线虫,经形态学观察、测量,以及rDNA-ITS区扩增测序分析,鉴定为阿苏里伞滑刃线虫.该线虫除韩国和中国台湾外,还未见在其他地方报道.     

首次截获的安东尼伞滑刃线虫的鉴定

宁波出入境检验检疫局植检实验室于2007年2月从来自法国的木质包装中截获一种伞滑刃属线虫。该线虫虫体较短,侧区有2条侧线,雄虫交合刺强壮,强烈弯曲,基顶高圆,喙突指状。雌虫有小阴门盖,尾圆锥形渐细,较平直或略向腹面弯曲,末端尖或钝圆,与树皮象伞滑刃线虫十分接近。经形态学比较、测量以及ITS-RFLP图谱比对,鉴定为安东尼伞滑刃线虫（Bursaphelenchus antoniae）。目前除葡萄牙外未见该线虫的报道。     

甘肃小麦禾谷孢囊线虫rDNA-ITS和28S rDNA-D2/D3区序列特征及HS-RFLP分析

禾谷孢囊线虫是危害禾谷类作物的重要病原,严重威胁我国小麦主产区的小麦产量和品质.利用通用引物对甘肃、河南、安徽禾谷孢囊线虫群体28S rDNA-D2/D3区和rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,利用UPG-MA方法分析了甘肃省7个种群、河南1个种群、安徽1个种群的禾谷孢囊线虫群体D2/D3区和ITS区的系统发育关系;用9种限制性内切酶对7个甘肃禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区进行了RFLP分析.结果表明:中国甘肃的禾谷孢囊线虫rDNA-D2/D3区片段长度约为780 bp,rDNA-ITS片段长度约为1 040 bp.7个甘肃禾谷孢囊线虫群体、1个河南安阳群体、1个安徽蚌埠群体的D2/D3区和新西兰的H.aucklandica群体亲缘关系很近;其ITS区同澳大利亚的H.australis、北京通州的H.avenae(AY148382)的亲缘关系很接近.RFLP分析表明,9种限制性内切酶酶切禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS共产生了22个酶切片段,不同酶切的RFLP分布型在7个种群间没有差异.甘肃省禾谷孢囊线虫群体的rDNA-ITS区具有高度的保守性,与中国的C型群体相近,但不同于欧洲的A型群体和印度的B型群体.这是首次报道甘肃CCN种群分子特征.     

宁波口岸首次截获弗氏伞滑刃线虫

宁波口岸于2008年7月从来自荷兰的木质包装中截获一种伞滑刃属线虫.该线虫虫体细长,侧区有4条侧线.雄虫交合刺细弱,基顶略呈方形,有时背弯;喙突显著,末端锐尖;远端有较小盘状突.尾乳突7个.雌虫有小阴门盖,尾圆锥形,尾端钝尖,有时呈尾尖突状.经形态学比较、测量以及ITSRFLP图谱比对,鉴定为弗氏伞滑刃线虫(Bursaphelenchus fuchsi Kruglik & Eroshenko,2004).目前除俄罗斯、德国外,未见该线虫的报道.     

河南郑州小麦禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)的核糖体基因ITS序列和RFLP分析

 采用PCR技术对河南郑州禾谷孢囊线虫群体的核糖体基因(ribosomal DNA,rDNA)内转录间隔区(Internal Transcribed Spacers,ITS)进行扩增,获得片段长度约为1040bp。利用UPGMA方法分析了河南郑州禾谷孢囊线虫群体与近缘种的系统发育关系,结果表明:中国Heterodera avenae群体,H.australis和H.pratensis亲缘关系很近。8种限制性内切酶(Restriction Enzyme,RE)酶切禾谷孢囊线虫ITS的扩增产物,其中HindⅢ、AvaⅠ不能酶切PCR产物;Alu Ⅰ酶切PCR产物,获得560bp和480bp2个片段;RsaⅠ和Hinf Ⅱ酶切后分别得到3个片段(700、320、20bp和820、180、40bp);CfoⅠ是3个酶切位点(740、150、110、40bp);HaeⅢ和MvaⅠ能分别清晰地观察到3个片段(420、350、180bp和400、340、280bp),但有微小片段无法清晰观察到。9个种群所得RFLP图谱一致,说明郑州禾谷孢囊线虫群体可能是同一种群且不同于欧洲群体(typeA)和印度群体(typeB)的C型。     

青海、陕西部分地区禾谷孢囊线虫 rDNA-ITS-RFLP的特征分析

 采自我国青海、陕西等省地11个寄生小麦的孢囊线虫群体经形态学鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)。用PCR技术扩增获得的rDNA-ITS片段长度约为1 060 bp。用Hinf Ⅰ、Taq Ⅰ、Hpa Ⅱ、Hae Ⅲ、Pst Ⅰ、Alu Ⅰ 等6种限制性内切酶酶切ITS扩增产物;青海10群体YBT10A、HY65A、HY61B、ZHZ162B、HY5B、HHX8A、GH132A、HY92A、HY127B、DT142A 的6个酶的RFLP图谱完全一致;陕西YL4A群体的Hae Ⅲ、Hinf Ⅰ和Hpa Ⅱ酶切结果与青海群体的上述3种酶切结果相同,但Alu Ⅰ和 Pst Ⅰ的酶切结果比青海孢囊线虫群体都多1条1 060 bp片段,而YL4A群体Taq Ⅰ酶切结果较为复杂。对比已知Avenae组成员RFLP图谱,青海群体与北京房山H.avenae群体的RFLP图谱一致;而陕西YL4A的Alu Ⅰ图谱与H.avenae法国群体一致,Pst Ⅰ和Taq Ⅰ却与Avenae组成员已知酶切结果均不一致。河南3个禾谷孢囊线虫群体除Taq Ⅰ酶切结果比青海CCN群体多1条520 bp片段以外,其他5种酶的RFLP都一致,而与澳大利亚的禾谷孢囊线虫H.avenae群体的RFLP图谱一致。     

厦门口岸首次从木包装中截获瓦里西伞滑刃线虫

厦门口岸于2011年6月从来自希腊的荒料石垫木中截获一种伞滑刃属线虫。经形态学比较、测量,该线虫虫体细长,侧区有4条侧线。雌虫有小阴门盖,尾圆锥形,略腹弯,尾端尖。雄虫交合刺成对,不愈合,显著腹弯,长约13～15μm;基顶前伸,端部圆滑,略背弯;喙突显著,末端钝尖,远端有小而明显的盘状突;雄虫尾部乳突7个。结合ITS-RFLP指纹图谱比对,进一步将该线虫鉴定为瓦里西伞滑刃线虫(Bursaphelenchus vallesianus Braasch,Schonfeld,Polomski,et al,2004)。     

山东省寄生烟草的孢囊线虫种类鉴定及种内群体间rDNA-ITS-RFLP分析

 在山东省5个植烟县/市采集烟草线虫土壤样本24份,其中10份土样中分离到孢囊线虫的孢囊,对之进行系统的形态学观测。孢囊阴门锥突出,双半膜孔,下桥和泡囊发达,阴门裂长（44.1±3.5） μm,阴门窗长（50.4±4.8） μm、宽（36.6±4.1） μm,下桥长（83.8±4.7） μm、宽（11.0±0.9） μm。利用大豆孢囊线虫特异性引物对分离到的孢囊线虫群体进行了分子鉴定。形态学和分子鉴定结果表明,山东省寄生烟草的孢囊线虫为大豆孢囊线虫Heterodera glycines Ichinohe,1952。对这10个孢囊线虫群体rDNA-ITS区进行了PCR扩增产物用7种限制性内切酶进行酶切和测序比对。发现,所有孢囊线虫群体均能扩增出一条大约1 000 bp大小的片段;用Alu Ⅰ、Bsh 1236 Ⅰ、Hae Ⅲ、Hha Ⅰ 、Mva Ⅰ 、Rsa Ⅰ酶切后,产生的酶切表型均相同;用Ava I酶切后,产生了2种酶切表型。所测孢囊线虫群体与GenBank收录的大豆孢囊线虫序列相似度高达99%以上。