转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法的建立

为了防止国外商业化生产的转基因番木瓜流入国内市场,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法,对于保护国内消费者知情权意义重大。本研究以转基因抗环斑病毒番木瓜 55-1 为研究材料,利用外源基因和番木瓜基因组序列设计了 9 对特异性检测引物,通过特异性引物筛选、熔解曲线分析、退火温度优化、特异性验证、灵敏度分析及检测限验证,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法。结果表明：本研究筛选出的检测引物,可特异的检出转基因番木瓜 55-1 转化事件,引物的检测灵敏度达到了 0.1%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求,完全可满足转基因检测标识制度的顺利实施。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因转化葡萄的研究

以根癌农杆菌介导的叶盘法转化技术将huIGF－Ⅰ基因转入葡萄组织细胞，并通过既成的再生－转化体系诱导筛选huIGF－Ⅰ转基因葡萄植株，在抗性筛选中使用卡那霉素浓度为（Kan.)40mg/L，使用的根癌农杆菌工程菌株为EHA105／pBIGF－Ⅰ、EHA105／pCIGF－Ⅰ。最后用PCR技术、Southern blot对转基因植株作分子鉴定，其检测阳性率分别为60％和66.6%。     

PRV—CP—SN转基因番木瓜表达与抗病能力的研究

通过ＲＮＡ斑点杂交和酶联吸附免疫试验等技术定性地分析了ＰＲＶ－ＣＰ－ＳＮ转基因番木瓜的表达，又通过大田接种攻毒试验检了ＰＲＶ－ＣＰ－ＳＮ转基因番木瓜的抗病能力。边为定量分析表达量和抗病能力关系研究奠定了理论的基础。     

农杆菌介导抗虫CpTI基因的花生遗传转化及转基因植株的再生

通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒介导途径，将抗虫CpTI基因转入花生，经过诱导分化获得转基因再生植株。PCR检测及Southern杂交鉴定结果表明，外源CpTI基因已整合到大部分再生花组中。通过抗虫性检测试验，转基因花生具有一定的抗虫性。     

番木瓜环斑病毒海南株系植物RNAi表达载体的构建

为研究广谱抗环斑病毒（PRSV）海南株系转基因番木瓜育种方案,采集海南番木瓜各主要种植区的PRSV株系,以外壳蛋白（CP）、辅助成分－蛋白酶（HC-Pro）和复制酶（Nib）基因作为靶标基因,通过序列比对和运用Clustalx软件分析,得到干扰基因的保守区域和挑选出海南PRSV典型株系的代表样品。以pUCCRNAi为骨架质粒,利用代表样品的CP、NIb、Hc-Pro基因片断保守序列构建RNAi发夹结构,将发夹结构导入pCAMBIA2300-35S-OCS植物表达载体,构建出抗PRSV植物表达载体pCAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS、pCAMBIA230035S-Hc-Pro-RNAi-OCS、pCAMBIA2300-35S-NIb-RNAi-OCS。实验将PRSV不同株系保守序列的分析与RNAi的高效抗病设计理念相结合,可用于创造高效、广谱抗PRSV病毒病的新种质。     

AGPase基因转化木薯获得转基因植株的研究

通过农杆菌介导法将一个提高淀粉含量的AGPase基因在块根特异启动子的调控下成功导入木薯华南8号(SC8)基因组,并获得转化抗性再生植株25株,转化率为1.20%。经生根初筛有19株转化植株能在抗性生根培养基生根,经PCR、Southern等分子检测证实这19株转化植株为转基因植株。     

向大豆导入几丁质酶基因的初步研究

以根癌农杆菌的Ｔｉ质粒为介导,将抗真菌病的几丁质酶基因,导入默经江省栽培大豆一东农３７号,吉林２８号等１４个品种。从子叶节和下胚轴诱导出丛生芽,并再生植株,经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测,经ＰＣＲ和ＤＮＡ分子杂交检测的１１３株大豆幼苗中,有７株呈阳性反应,证明几丁质酶基因已导入并整合到大豆的基因组中。     

大豆遗传转化的研究进展

通过农杆菌介导、电击、花粉管通道与微注射及基因枪等方法进行的大豆遗传转化研究分别取得了不同程度的进展，有的已获得表达目的基因的转基因后代材料，但各种转化方法都不同程度地存在转化频率偏低的问题。本文综述大豆遗传转化研究取得的成绩、存在的问题及应用前景。     

成龄番木瓜的快繁技术

以番木瓜（泰国木瓜）的大田成龄植株之侧芽为材料，对取材的位置、外植体的消毒方法、继代增殖培养、催根及移栽等环节做了较系统的研究，从中找到了一套适合成龄番木瓜的侧芽的无性繁殖技术，为番木瓜良种的繁殖和种质的保存提供了一条有效的途径。     

根癌农杆菌介导的环斑病毒外壳蛋白基因转化番木瓜的研究

利用杂种一代番术瓜(cariea papaya L.)实生苗的下胚轴及无菌苗的茎段、叶片等外植体与根癌农杆菌共培养的方法(即改良的叶盘法),将PBIU1质粒上的新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)和环斑病毒外壳蛋白基因(PRSV—CP)导入番木瓜细胞的核基因组中。经共培养的外植体在含有卡那霉素(kan,100μg/ml)的选择培养基上产生抗性的愈伤组织,并通过体胚发生途径再生植株。NPTⅡ分析证明,NPTⅡ基因已在再生植株中稳定地表达。Southern blot分子杂交证明,PRSV—CP基因已整合到番木瓜的核基因组中。本研究已获得转PRSV—CP基因植株,并且在苗床移栽成活。     

番木瓜干旱胁迫相关CpDHN基因的克隆与原核表达

本研究基于转录组获得的CpDHN转录本序列,以番木瓜‘台农二号’组培苗叶片为材料,采用RT-PCR技术克隆了该基因包含完整ORF在内的425 bp cDNA序列。序列分析表明,CpDHN预测编码93个氨基酸,其理论分子量为10.50 kDa、等电点为6.62、总平均疏水指数为-1.984、核定位。除保守的K片段外,蛋白还含有1个S片段,可归为KS型脱水素。在拟南芥中的10个脱水素中,CpDHN与AtLEA8的亲缘关系最近,相似性为53.3%。值得注意的是,虽然CpDHN的编码区不存在内含子,但其3°UTR含有1个与AtLEA8类似的内含子。表达谱分析显示,该基因在根和叶片中均受干旱胁迫诱导。此外,还构建了CpDHN的原核表达载体,SDS-PAGE分析显示,该蛋白在大肠杆菌中可高效表达。这些结果为下一步的功能鉴定奠定了坚实的基础。     

番木瓜不同株性植株初蕾前后叶片的内源激素水平

在番木瓜初蕾前后,以嫩叶为材料,采用高效液相色谱(HPLC)技术,测定番木瓜雌株、两性株及雄株内源激素含量的变化.结果显示:番木瓜3种株性植株叶片的GA3、IAA、ZR、ABA含量在花芽分化、现蕾及开花3个发育阶段均具有明显的变化规律和差异性,且变化临界点为初蕾形成时.内源激素含量比值变化表现为,雄株在初蕾前后ZR/IAA与ZR/ABA比值一直明显高于雌株和两性株的;雌株的IAA/GA3与IAA/ABA比值在初蕾时出现1个明显的高峰值;3种株性植株叶片的GA3/ZR比值则均呈现出初蕾前较低,而初蕾后逐渐上升的趋势.     

2个番木瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR扩增获得了2个番木瓜果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因cDNA和DNA全长序列,将其命名为CpPGIP1和CpPGIP2.CpPGIP1基因全长为984 bp,编码325个氨基酸;CpPGIP2基因全长为1 025 bp,编码326个氨基酸.2基因均没有内含子序列,核苷酸序列有66.54％的相...     

番木瓜优质组培苗生产体系的建立

用含有100mg/LVc＋1mg/LAgNO;+20mg/LPVP液体处理成龄番木瓜（CricappayaL）侧芽,再用70%酒精浸泡50s、0.15%升汞消毒5min,经消毒的外植体接种于MS+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L+GA31.0mg/L＋30g/L蔗糖+7g/L琼脂（pH=5.7）,26~28℃,每日光照培养12h,光照强度为15001x,连续培养20d;外植体经初始培养后,继代接种于MS＋BA0.5mg/L+NAA0.1 mg/L+GA,1.0mg/L+蔗糖30gL＋琼脂7g/L（pH=5.7）,26~28℃,每日光照培养16h,光照强度为2000Ix,连续培养40d,繁殖系数达3~5倍;继代芽接种MS+BA0.2mg/L+KT0.3mg/L+NAA0.Img/L+NAA0.1 mg/L+GA;1.0 mg/L+ADS40mg/L＋蔗糖30g/L＋琼脂7g/L（pH=5.7）,26~28℃,每日光照培养16h,光照强度为20001x,连续培养20d进行壮苗培养,经壮苗培养芽接种于MS+KT0.1~0.2mg/L+ NAA0.05~0.1mg/L+ IBA0.2-0.3mg/L+蔗糖20~30gL+琼脂6.5g/L（pH=5.6）,26~28℃,每日光照培养12h,光照强度为1500kx,连续培养 15~20d 进行催根培养,生根率达85%以上。生根苗经2~3d的自然光炼苗后,移栽于沙土∶椰糠∶菜园土质量比为1∶1∶1 混和的基质中,移苗后1周内,每天喷施浓度为200～400mg/L的IBA,移栽成活率达80%以上。笔者就目前番木瓜组培快繁中的问题作了系统的研究,建立了一套适合番木瓜优质种苗生产的技术体系。     

番木瓜叶片、叶柄胚性愈伤组织的诱导及其体胚植株的发生

以“漳红”番木瓜组培苗的叶片和叶柄为外植体,在改良MS＋0．5mg／LKT＋1．0mg／L2,4-D＋0．5mg／L BA＋0．1mg／L NAA＋400mg／L Glu＋30g/L蔗糖的固体培养基上诱导出了胚性愈伤组织。其中,CⅡa型胚性愈伤在一定条件下能够继代增殖,并能向CⅡb型转变,CⅡb型胚性愈伤则容易发生体胚。采用两步生根法,将体胚再生植株先接种于1／2 MS＋0．5mg／L IBA＋1．0g/L AC＋30g／L蔗糖的固体培养基中暗培养7d后,转移至1／2 MS＋1．0g/L AC＋25μmol／L VB2＋30g/L蔗糖的固体培养基上光照培养,生根效果最好。移栽后,成活率可达45％以上。     

番木瓜β-Gal基因的克隆分析与植物表达载体构建

番木瓜果实采后贮藏期间的迅速软化与β-Gal基因的表达密切相关。利用常规PCR结合反向PCR技术,分离了一条4501bp的番木瓜β-Gal基因组序列。其共含有17个内含子,外显子部分与相应的cDNA序列只有1个碱基的差异。生物信息学分析结果表明,该番木瓜β-GAL属于糖苷水解酶超级家族42中家族35的成员,在进化过程中与拟南芥的亲缘关系较近,与鳄梨和北美云杉则较远。同时,它还具有一段定位于胞外的信号肽,再次表明其可能参与了果肉细胞壁的降解和果实软化。进一步分离了β-Gal基因启动子,初步验证了其果实表达特异性。将该启动子替换载体p2301/TTRG上的CaMV 35S启动子,构建出RNAi-β-Gal双T-DNA植物表达载体。酶切分析和PCR检测结果表明,载体p2301/BPTTRG已被成功导入农杆菌,可用于后续的遗传转化研究。     

Cry1Ab基因转化甘蔗及转基因抗虫植株的获得

构建玉米UBI启动子驱动Bt Cry1Ab基因的高效植物表达载体pUBTB,通过农杆菌介导法导入甘蔗愈伤组织,经过除草剂PPT三次连续筛选,共获得67株抗性植株,经PCR扩增检测,得到22株阳性植株,并对其进行RT-PCR检测,证明外源基因已经成功整合到其中的15株甘蔗基因组中,且得到了有效的表达。     

番木瓜酪氨酸氨基转移酶基因CpTAT的分离与分析

番木瓜酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)是维生素E合成途径中的一个关键酶。在已有番木瓜果实成熟差异基因片段序列的基础上,采用RACE技术克隆了TAT基因的全长c DNA序列,命名为Cp TAT。该基因全长包含5′非编码区98 bp,3′非编码区232 bp,开放性阅读框1 266 bp,编码421个氨基酸。序列分析表明,该基因为谷草转氨酶超家族成员,催化活性位点为第253位的赖氨酸,编码蛋白与毛果杨、野草莓、桃、拟南芥和水稻的TAT蛋白同源性分别为83.69%、81.09%、80.76%、78.87%、54.67%。荧光定量分析表明,Cp TAT基因在根中的表达量最高,在茎和果实中的表达较低,在叶中的表达量最低。与对照相比,外源乙烯处理能诱导番木瓜果实中Cp TAT基因表达量升高,而1-MCP处理则抑制了该基因表达,在果实衰老期表达量升高,该基因可能在番木瓜果实成熟衰老中起作用。