虾蛄活性肽的分离与纯化及其对肿瘤细胞凋亡的影响

[目的]为海洋抗肿瘤新药的开发提供候选药物.[方法]以海洋生物虾蛄为原料,采用胰蛋白酶水解提取虾蛄软体组织中的活性多肽,采用超滤、凝胶层析、高效液相色谱等技术对其进行分离与纯化,并选择高表达肿瘤细胞株进行体外抗肿瘤活性评价.[结果]获得纯度较高的活性肽FHOS,此肽的氨基酸序列为Phe Tyr Met Asn His.采用MTT法测得FHOS对PC-3细胞和A549细胞的最高增殖抑制率达到70.1％和90.0％,呈现良好的量效和时效关系.[结论]FHOS具有一定的抑制肿瘤细胞凋亡的活性.     

牛IL-2 cDNA缺失突变的矫正及表达产物生物学活性测定

根据GenBank中的牛IL-2基因序列，设计一对引物Pa和Pd，以牛外周血淋巴细胞为材料，用RT-PCR方法扩增得到牛IL-2 cDNA，测序发现在扩增产物的第240位缺失了一个A碱基。采用重叠延伸剪接术(SOE法)向突变体定点插入该碱基，然后与表达载体连接，获得了正确的表达产物。经RT-PCR检测证明，重组的牛IL-2蛋白具有较好的生物学活性，能诱导肿瘤坏死因子TNF-α和干扰素IFN-γ的产生。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

交替氧化酶的原核表达、纯化及活性研究

利用原核表达系统BL21和FN102表达交替氧化酶,用镍-NTA(Ni-NTA)琼脂糖凝胶层析柱纯化交替氧化酶可溶蛋白,利用SDS-PAGE检测纯化蛋白电泳纯度,用分光光度法测蛋白活性.结果表明:FN102表达的交替氧化酶量高于BL21;在BL21表达系统中的蛋白电泳纯度＜10％,而在FN102中表达的纯化蛋白电泳纯度达到90％～95％;BL21中表达交替氧化酶纯化蛋白活性为165.1 nmol/(min· mg),FN102中表达的交替氧化酶纯化蛋白活性为64.0 nmol/(min·mg).     

定点突变FGF21提高表达量研究

FGF21是一类具有重要糖脂代谢调节功能因子,是治疗2型糖尿病候选药物。但其在大肠杆菌中表达量低且主要以包涵体形式表达,为此根据FGF21与FGF家族同源序列差异,对FGF21进行定点突变以提高其表达量。以pSUMO-FGF21表达载体为模板,在突变位点两端设计引物,采用定点突变方法,将FGF21141位甘氨酸(G)突变为苯丙氨酸(F),构建突变FGF21表达载体pSUMO-mutFGF21;在大肠杆菌中进行表达,纯化mutFGF21蛋白。利用SDS-PAGE和Western blot鉴定分析突变蛋白,HepG2细胞糖吸收试验检测突变蛋白活性。结果成功对pSUMO-hFGF21进行突变,突变蛋白在大肠杆菌中成功表达,经SDS-PAGE分析,主要以可溶形式表达;与野生型FGF21(hFGF21)相比,表达量提高50%。Western blot表明mutFGF21可与FGF21抗体特异性反应。糖吸收试验显示mutFGF21具有与hFGF21一样生物活性并存在剂量依赖性,相比hFGF21,mutFGF21活性略有提高,说明定点突变FGF21(141位G突变为F)可显著提高FGF21表达量。     

鲎抗菌肽polyphemusinⅡ基因的改造、克隆及其在大肠杆菌中的表达

中国鲎(Tachypleus trideutatus)血细胞产生的抗菌肽(Antibacterial peptide)—鲎素,具有广谱的杀菌、抑病毒和抗肿瘤细胞的作用。实验根据已报道的美洲鲎的抗菌肽polyphemusinⅡ氨基酸序列,设计了一对引物,并对原抗菌肽基因进行改造,在基因开放阅读框末端添加了Asn密码子,使抗菌肽羧基末端酰胺化,旨在提高其稳定性和抗菌活性。PCR扩增获得改造过的目的片段,连接于载体pMD18-T,测序后,与pEI-28c(+)连接,构建表达质粒pET28c-rr,测序鉴定正确后,转化大肠杆菌E.coli.BK21(DE3)。表达菌株经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导后以包涵体的形式表达,在体外表现出明显的抑菌活性。     

猪内源性反转录病毒5′非编码区启动子活性的分析

 【目的】构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒（PERV）5′非编码区（5′UTR）为启动子的萤光素酶表达载体，分析5′UTR的转录调控规律。【方法】将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上，转染瞬时表达细胞Cos-7，检测萤光素酶的表达。【结果】缺失R区的5′UTR显示出很强的启动子活性，U3重复区序列缺失的5′UTR启动子活性显著下降。UTR显示出较之LTR强的启动子活性。缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强。【结论】在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降；U3重复区序列表现出增强子的活性。在5′UTR的下游序列中，包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强，同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5′UTR的转录活性。     

HIV-1可溶性单链抗体b12-scFv的表达与活性分析

【目的】合成并克隆HIV-1单克隆抗体b12的单链抗体基因,在大肠杆菌中诱导表达,并分析表达产物的活性。【方法】以单抗b12的重链和轻链全基因为模板,分别扩增其可变区基因片段后,用重叠PCR的方法将二者拼接起来,形成scFv-VL-Linker-VH结构,并将其插入pET28a载体,构建原核表达载体pETb12-scFv。将pETb12-scFv转入大肠杆菌BL21StarTM(DE3),经IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE分析;用Ni-NTA金属螯合层析柱对表达产物进行分离纯化,用酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光显微镜和流式细胞仪(FCM)检测纯化蛋白与HIV-1gp120的结合活性。【结果】得到了b12的单链抗体基因b12-scFv,长度为768bp;SDS-PAGE电泳结果显示,b12-scFv表达量较高,蛋白质分子质量约为29ku,主要以可溶性蛋白的形式存在,但也有部分形成不溶的包涵体;纯化后蛋白的产量约为2mg/L;活性检测结果表明,b12-scFv对分泌表达和锚定在细胞膜表面的HIV-1gp120都具有良好的特异性结合活性。【结论】单链抗体b12-scFv可以用于HIV-1受体结合位点的表位检测。     

牛金属硫蛋白素bMTcin编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

以本实验室由RT-PCR扩增得到的含有牛金属硫蛋白（bMT）cDNA的重组质粒pYJ101为模板，PCR扩增出牛金属硫蛋白素bMTcin的编码区，将其克隆到pGEM-T载体上并进行DNA序列测定。利用融合表达载体pGEX4T-1，在E.coli中诱导表达bMTcin，经过Glutathine Sepharose 4B亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测GST:bMTcin的条带。结果表明，所克隆的bMTcin序列全长为141bp，其DNA序列与原模板中的序列完全相同，与GenBank中另外5个bMTcinDNA相比，第31位和86位与Conneely的序列为A和G，导致第11位（Thr）第29位（Arg）的氨基酸不同于其他4个序列（11位为Ala，29位为Lys）。融合表达蛋白GST:bMTcin的表达量大约为1.1mg/L发酵液。     

Enterocin A在大肠杆菌中的表达及活性检测

将含有编码成熟Enterocin A的基因片段BAE2克隆到pET-28 a( )大肠杆菌表达系统中,在IPTG诱导下,工程菌表达了可溶性的融合多肽His tag-enterocin A,以金属鳌和层析对其进行纯化。利用琼脂扩散试验检测表达产物及纯化产物的抑菌活性。结果表明:His tag-enterocin A具有抗李斯特氏菌活性,但对所选用的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌不表现抑制作用,显示与Enterocin A相似的抑菌活性。     

产Zwittermicin A的苏云金芽孢杆菌菌株的筛选及抗性基因zmaR的克隆与表达

 通过PCR方法筛选160株苏云金芽孢杆菌，其中94株含有zmaR基因。测定了含zmaR基因的菌株培养物上清液对草生欧文氏杆菌（Erwinia herbicola）的抑菌活性，结果表明有67株菌有抑菌活性，其中21株抑菌活性较高。经鉴定，抑菌活性较高的G03菌株含有cry1Ac、cry1Aa、cry1Ca和cry2Ab等高毒力杀虫基因，并从G03中克隆了zmaR全长基因，完成了序列测定。该基因编码区为1 125 bp，由核苷酸序列推导的氨基酸残基组成为375个，分子量为43.5 kD，等电点pI4.945。通过载体pET-21b将zmaR基因导入大肠杆菌BL21，可正常表达43.5 kD蛋白，并使宿主菌产生对Zwittermicin A的抗性。     

芽孢杆菌糖基水解酶GH489的表达及生物活性研究

为了探究芽孢杆菌(Bacillus sp.)糖基水解酶GH489的生物活性，通过设计特异性引物扩增得到目的基因gh489，采用大肠杆菌原核表达系统对重组GH489蛋白进行表达，利用组氨酸标签对目的蛋白进行分离纯化，并检测芽孢杆菌糖基水解酶GH489对二斑叶螨的杀螨活性。结果表明，由大肠杆菌BL21(DE3)表达的重组GH489蛋白为可溶性蛋白质，其蛋白质分子质量约为57 kDa。纯化后的GH489重组蛋白显示出良好的杀螨活性，处理24 h后，二斑叶螨的半致死浓度(LC₅₀)为30.296μg/mL，处理48 h后，二斑叶螨的半致死浓度(LC₅₀)为21.212μg/mL。     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

鸡β-防御素3(Gal-3)基因的克隆、表达及抑菌活性研究

【目的】克隆和表达鸡β-防御素3(Gal-3)基因,并对其抑菌活性进行研究,为寻找替代抗生素的抗菌肽提供试验依据。【方法】利用RT-PCR方法,从鸡心脏中分离并克隆了鸡Gal-3基因,将其与分子伴侣基因SUMO相融合,再将该融合基因与原核表达载体pET-20b连接后转化至BL21(DE3)宿主细胞中,经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析;最后,对Gal-3融合蛋白进行纯化,并对表达产物进行体外抑菌试验。【结果】通过RT-PCR扩增获得了约240bp的鸡Gal-3基因,经IPTG诱导获得约26ku的蛋白。IPTG在终浓度为0.6mmol/L,33℃诱导4h,诱导时菌体A600为0.6,蛋白表达量最高,且多数以可溶形式存在,33℃上清中的蛋白含量比37℃上清高。纯化的蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌活性。【结论】成功克隆并表达了鸡Gal-3基因,其原核表达产物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌活性。     

牛RECQL解旋酶的原核表达纯化及解旋条件优化

【目的】通过大肠杆菌表达纯化牛(Bos taurus)RECQL蛋白,利用停流光谱技术对解旋条件进行优化,为研究RECQL的酶促反应动力过程奠定基础。【方法】将人工合成的牛RECQL蛋白编码序列与pET21a载体相连接,获得重组表达载体pET21a-BtRecql后,将其导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株中进行诱导表达,经过Ni-NTA亲和层析和Superdex 200凝胶过滤层析,得到纯化的重组蛋白BtRECQL;再利用停流光谱技术对BtRECQL解旋过程进行检测分析,通过摸索不同的试验参数找到BtRECQL发挥解旋功能较适宜的条件。【结果】得到了纯度大于95%的BtRECQL蛋白,产量为0.29 mg/L。在BtRECQL浓度为60nmol/L,反应条件为1.0 mmol/L ATP,30mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,60mmol/L NaCl,1mmol/L MgCl2,2mmol/L DTT,孵育温度为37℃时,该蛋白解旋活性较好。【结论】成功表达并纯化了BtRECQL蛋白,确定了其最优的解旋条件。     

动物生物制品与饲料生物添加剂主要进展

中国在木聚糖酶、淀粉酶和高比活植酸酶的开发中取得了显的进展，3种酶制剂在pH值2～7的范围内都保持了较高的活性，最适反应温度在50～55℃，即使在80℃高温作用30min后，3种酶的剩余活性仍可达到89％、74％和85％。3种酶制剂还表现了极好的耐蛋白酶活性，经0．1mg／mL胃蛋白酶或胰蛋白酶作用1h后生物活性不受影响。其中，植酸酶的比活性可达到360万国际单位／mg，是国外基因工程曲霉生产的植酸酶比活性的36倍，生产表达量达到2．2g／L发酵液；木聚糖酶比活性达2869国际单位／mL，生产表达量达到2．3g／L，而国外较好的比活性只有1250～2100国际单位/mL；淀粉酶的生产表达量也达到了3g／L，属于国际先进水平。2001年我国在饲料用酶制剂方面申请的发明专利达到了12项，分离克隆的新基因超过12个。     

一株放线菌发酵产物抗肿瘤活性的研究

[目的]研究一株放线茵发酵产物的抗肿瘤活性。[方法]采用HepG2作为肿瘤细胞模型进行抗肿瘤活性检测。[结果]用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取发酵液离心后的沉淀和上清液,分别得到6个浸膏样品。发现用乙酸乙酯萃取上清液得到的5号样品抗肿瘤活性最高,在没有分离纯化的情况下G1 50达到0．76μg,／ml。对5号样品进行分离后得到物质A,在其浓度为10．00μg／ml时,对肿瘤细胞抑制率为26．50％。[结论]此株放线菌发酵产物具有高效抗肿瘤活性,可以进行深入研究。     

瑞香狼毒根丙酮提取物对几种动物病原菌的抑制作用

根据瑞香狼毒根中黄酮类物质的理化性质,将其丙酮提取物分为黄酮类A和非黄酮类B两部分。选用嗜水气单胞菌、肠型点状产气单胞菌、哈维弧菌、鳗弧菌、无乳链球菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等8种菌作为供试菌(前4种为水产病原菌;后4种为哺乳动物病原菌),结合活性跟踪采用倍比稀释法进行抑菌活性测定。结果表明,A部分对供试菌均有较强抑制活性,并从其中分离到两个有较强抑菌活性的化合物新狼毒素B(A1)和狼毒色原酮(A2);B部分对水产病原菌有较强抑制活性,并从其中分离到一个有较强抑菌活性的香豆素类化合物伞形花内酯(B1)。     

FMDV非结构蛋白3A和3B的表达与反应活性分析

根据已测得的O/China/99口蹄疫病毒(FMDV)基因组序列,设计两对特异性表达引物,以带有O/Chi-na/99 3ABC基因片段的重组质粒pGEM-3ABC为模板,扩增得到了3A、3B基因,通过两端的BamHI和SalI酶切位点插入原核表达载体pET28a,将重组表达质粒转化宿主菌BL21,用IPTG诱导表达目的蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测表明,3A和3B基因成功的在大肠埃希氏菌中得到了表达;通过Western blotting分析和斑点ELISA分析表明,纯化后的蛋白能与FMDV感染动物血清发生特异性反应.     

猪内源性反转录病毒5''非编码区启动子活性的分析

[目的]构建以缺失不同功能区的猪内源性反转录病毒(PERV)5'非编码区(5'UTR)为启动子的萤光素酶表达载体,分析5'UTR的转录调控规律.[方法]将含有不同功能域的PERV的UTR克隆至萤光素酶表达载体上,转染瞬时表达细胞Cos-7,检测萤光素酶的表达.[结果]缺失R区的5'UTR显示出很强的启动子活性,U3重复区序列缺失的5'UTR启动子活性显著下降.UTR显示出较之LTR强的启动子活性.缺失整个U3区的UTR比仅缺失U3重复区的UTR启动子活性强.[结论]在R区有转录因子的结合位点可引起转录活性下降;U3重复区序列表现出增强子的活性.在5'UTR的下游序列中,包括引物结合区(PBS)和前导序列(Leader)可能有某些转录因子的结合位点引起转录增强,同时在U3重复区的上游和下游序列可能存在某些转录因子的结合位点可减少5'UTR的转录活性.