石榴ISSR-PCR反应体系的正交设计优化

现利用正交设计L16(45)探讨DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶对石榴ISSR-PCR反应体系的影响,首次应用加权平均法及百分制对正交实验结果进行评分,并应用DPS数据处理系统进行数据分析;同时对石榴ISSR-PCR最佳反应体系进行退火温度梯度试验。结果表明:适合石榴的ISSR-PCR最优反应体系(25μL)为:Mg2+1.75 mmol/L、dNTPs0.15 mmol/L、TaqDNA聚合酶1 U、引物0.8 mmol/L、DNA模板20 ng;引物UBC 811的最适退火温度为51.2℃,且最适退火温度因引物而异。     

正交设计优化莲藕ISSR-PCR反应体系研究

利用正交实验设计的方法,对莲藕ISSR-PCR反应的四因素(TaqDNA聚合酶浓度、dNTP浓度、引物浓度、Mg2+浓度)三水平进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果表明:20μL的ISSR-PCR反应体系中各因素的最佳浓度为:10×PCRbuffer 2.0μL、dNTP150μmol/L、引物1.2μmol/L、Mg2+2.0 mmol/L和TaqDNA聚合酶4 U,最佳模板DNA浓度为40～60 ng,引物U826的最佳退火温度为48.7℃。     

杜鹃属ISSR-PCR反应体系优化

为了优化杜鹃属ISSR-PCR反应体系,以“毛叶杜鹃”叶片为试验材料,应用正交试验与单因素试验相结合,对PCR反应体系的因素Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物及DNA模板进行优化组合,确定杜鹃属植物ISSR-PCR的20μL最优反应体系为:Mg2+1.5mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、模板DNA 20ng、引物0.9μmol/L、d NTPs 0.2mmol/L。     

鸭梨Hc ISSR-PCR反应体系的优化

应用正交设计的方法对影响鸭梨Hc ISSR-PCR反应的4个因素(模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶)进行5个水平的优化试验,以DPS 7.55软件分析。结果表明:鸭梨HcISSR-PCR的最佳反应体系(20μL)为:模板DNA 60 ng、引物浓度0.4μmol/L、dNTPs浓度0.1mmol/L、TaqDNA聚合酶2 U。     

利用正交试验建立橄榄的ISSR-PCR反应体系

采用正交试验设计,对影响橄榄ISSR-PCR的5个主要因素(Mg2+浓度、dNTP、Taq DNA聚合酶、模板DNA浓度和引物浓度)在4个水平上进行优化筛选,建立了适合橄榄ISSR-PCR反应的最佳体系。即20μl体系中含有Mg2+3.0 mmol/L、dNTP 0.225 mmol/L、Taq DNA聚合酶1 U、模板DNA80 ng和引物0.25μmol/L,利用该体系对多个橄榄品种进行ISSR分析取得良好结果。     

国兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交设计与单因素结合法,对国兰ISSR-PCR反应体系中的4个因素(dNTPs、引物浓度、Mg2+、Taq DNA聚合酶)进行优化试验,结果用DPS软件进行分析.结果表明:各因素对PCR结果均有显著影响,其中Taq DNA聚合酶对反应的影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立国兰ISSR-PCR的最佳反应体系(25μL)为:dNTPs 0.2mmol/L、引物1.0 μmol/L、Mg2+2.5 mmol/L、Taq DNA聚合酶1U.     

锥栗自然居群ISSR-PCR分析技术的建立

提取野生锥栗的基因组DNA作为ISSR-PCR模板,对反应体系中的模板用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和TaqDNA聚合酶用量5个主要影响因素进行梯度试验,并对扩增程序中的退火温度与循环次数进行了探讨,初步确立了适合野生锥栗的ISSR-PCR分析技术体系,即25μL反应体系中,模板DNA40或50ng、Mg2+2.25mmol.L-1、dNTPs0.2mmol.L-1、引物0.2μmol.L-1、TaqDNA聚合酶1.0U;PCR扩增程序为:94℃预变性3min;然后94℃变性45s,(Tm+2～4℃)退火45s,72℃延伸2min,共32个循环;最后72℃充分延伸5min;1.5%琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。     

茶花品种ISSR指纹图谱反应体系建立与优化

以30个茶花品种为试材,采用5因素4水平正交实验以及单因素优化试验方法,研究Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR指纹图谱条带清晰度的影响,以进行茶花品种ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选。结果表明:茶花品种ISSR-PCR最适扩增条件为25μL反应体系中,Mg2+3.0mmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、引物0.3mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、模板DNA 80ng以及52.1℃退火温度;试验从100个ISSR引物中筛选出12个适用引物;并对12个ISSR引物的多态性和稳定性进行了检验。     

正交设计优化大白菜ISSR-PCR反应体系

以大白菜为试材,采用新型植物基因组DNA提取试剂盒提取大白菜基因组DNA,采用正交实验设计方法,对dNTPs、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、及模板DNA五因素四水平进行优化,筛选并建立了适合大白菜的ISSR-PCR反应体系。结果表明:25μL的反应体系中含有1.5mmol/L Mg2+、200μmol/L dNTP、0.5UTaq DNA聚合酶、0.7μmol/L引物、30ng模板DNA。在此基础上探讨了最佳循环次数,应用该优化反应体系,用3个不同循环数对资源DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系适宜的循环次数是30。     

茄子ISSR-PCR反应体系优化及验证

以茄子为试验材料,采用改良CTAB法提取茄子嫩叶总DNA,结合单因素设计和正交设计L9(34)的优点,探讨Mg2+、dNTP、引物及TaqDNA聚合酶等因素对茄子ISSR-PCR反应体系的影响,利用16份广西茄子主要栽培品种对最优处理组合进行验证。结果表明,在25μL反应体系中,含2.5μL10×buffer、2.0～3.0mmol·L-1Mg2+、0.32～0.36mmol·L-1dNTP、0.4μmol·L-1引物、50ng模板DNA、0.6UTaqDNA聚合酶等成分,可以获得比较稳定、清晰和丰富的条带。     

应用正交设计优化江南牡丹RAPD-PCR反应体系

以牡丹品种"云芳"基因组DNA为模板,采用正交实验设计L25(55)对影响牡丹RAPD-PCR反应的5因素(模板DNA、引物、Mg2+、dNTPs、Taq酶)在5个水平上进行优化试验。结果表明:最佳的RAPD-PCR的反应体系为:20μL体系中含有25 ng的模板DNA,0.2μmol/L的引物,Mg2+1.0 mmol/L,1×buffer反应缓冲液,DNTPs各为0.2 mmol/L,1.0 U的TaqDNA聚合酶。     

杜鹃花ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以杜鹃花为试验材料,采用正交实验方法,研究模板DNA浓度、ISSR引物浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶浓度、Mg2+浓度等5个因素对ISSR-PCR反应体系的影响,以建立适合杜鹃花的ISSR-PCR最佳扩增体系。结果表明:杜鹃花ISSR反应体系的最佳条件为模板DNA用量为60ng/20μL,ISSR引物浓度0.60μmol/L,dNTPs浓度0.50μmol/L,Taq DNA聚合酶浓度30U/mL,Mg2+浓度为0.6mmol/L。采用该反应体系可以从10份杜鹃花(R.simsii)基因组内扩增出稳定性高、重复性好ISSR-PCR产物。该研究为杜鹃花的遗传多样性分析、ISSR指纹图谱构建、亲缘关系鉴定等研究奠定了基础。     

云南松ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立和优化云南松ISSR-PCR反应体系,运用正交实验分析了模板DNA、TagDNA聚合酶、引物、Mg~(2+)和dNTPs 5个因子对云南松ISSR-PCR反应的影响。结果表明:云南松ISSR-PCR 25μL反应体系中5个因子最佳水平为:DNA模板为3.6 ng、TagDNA聚合酶为2.0 U、引物浓度为0.8 mmol/L、dNTPs浓度为0.20 mmol/L、Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L。     

链格孢属小孢子种ISSR和RAPD-PCR最佳反应体系的建立

以13个链格孢属小孢子种菌株为试材,采用正交实验设计的方法,研究Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶和引物4个因素在4个水平上对链格孢属小孢子种的ISSR和RAPD反应体系的影响。结果表明:链格孢属小孢子种ISSR和RAPD的最佳反应体系为25μL的ISSR-PCR反应体系中,10×PCR Buffer 2.50μL,Mg2+浓度为2.50mmol/L,dNTPs浓度为0.10mmol/L,引物浓度为0.30μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.25U;在RAPD-PCR反应体系中,10×PCR Buffer 2.50μL,Mg2+浓度为2.00mmol/L,dNTPs浓度为0.15mmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,Taq DNA聚合酶用量为1.25U;在此基础上,对最佳反应体系的退火温度进行了筛选确定;在确定退火温度后,采用最佳反应体系,用ISSR引物UBC808和RAPD引物OPE07进行稳定性和通用性验证,结果表明该优化反应体系具有较好的稳定性和通用性。     

利用正交设计优化辣椒SRAP反应体系

为快速建立优化的辣椒SRAP反应体系,利用L9(34)正交表,探讨了Mg2+、dNTPs、引物和模板DNA4种主要反应成分的浓度变化对SRAP扩增结果的影响。结果表明:通过正交设计实验可高效建立优化稳定的辣椒SRAP反应体系;用该法建立的辣椒SRAP优化反应体系为:20μL反应体系中含10×PCRBuffer 2.0μL、Mg2+2.5 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L,上下游引物各0.4μmol/L、模板DNA10 ng,TaqDNA聚合酶1 U。     

正交设计优化果梅ISSR反应体系

以果梅(PrunusmumeSieb.etZucc.)品种鸳鸯梅为试材,采用改良的CTAB法提取果梅嫩叶DNA,利用正交设计L16(45)探讨Mg2+、dNTPs、引物、TaqDNA聚合酶及模板DNA用量对果梅ISSR-PCR反应的影响,正交试验的结果采用直观分析和方差分析相结合。建立了果梅的ISSR-PCR优化反应体系,在20μL反应体系中含2μL10×Buffer,2.5mmol·L-1Mg2+,0.2mmol·L-1dNTPs,0.32μmol·L-1引物,20~80ng模板DNA,0.75UTaqDNA聚合酶。在此基础上探讨了引物UBC840的最适退火温度、最佳循环次数及延伸时间,引物UBC840的最适退火温度为50.6℃。应用该优化反应体系,用2个不同引物对19份果梅资源DNA进行ISSR-PCR扩增,结果显示优化的反应体系具有较高的稳定性。     

苹果SSR反应体系的建立

为摸索适宜苹果的SSR反应体系,以金冠苹果为试验材料,研究了苹果SSR技术中PCR反应体系的主要成分对SSR扩增结果的影响。对SSR反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、模板浓度以及退火温度进行了探索,确立了适合苹果的SSR反应体系为:在20μL反应体系中,Mg2+、引物和dNTP的最适浓度分别为2.5mmol/L、0.8μmol/L、0.10mmol/L;反应体系中TaqDNA聚合酶宜加入1U,模板DNA应加入15-30ng;引物的最佳退火温度为48.5-52.0℃。并利用该反应体系对10个苹果代表品种进行SSR反应,用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同品种间DNA谱带多态性丰富,证实该体系稳定可靠。     

杨桃SCoT标记PCR反应体系建立与验证

用单因素设计法对影响杨桃SCoT-PCR反应体系的主要因素Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶及DNA模板浓度进行优化。结果表明,20μL反应体系中,含Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.3mmol/L,模板DNA 30mg/L,引物1.00μmol/L和Taq DNA聚合酶0.4U为最佳反应体系。用不同引物及杨桃DNA对该体系进行验证,扩增条带清晰,结果稳定可靠,证明该反应体系适用于杨桃SCoT-PCR扩增。     

观叶福禄桐ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以福禄桐叶片为试材,采用正交实验和单因子试验,分析模板DNA、Mg2+、Taq酶、引物和dNTP五个因子对福禄桐ISSR-PCR反应的影响。结果表明:福禄桐ISSR-PCR最佳反应体系为在25μL反应体系中,模板DNA为15ng,Mg2+3.0mmol/L,Taq酶0.5U,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20mmol/L,通过梯度PCR试验得到相应引物最佳退火温度为47℃;该试验可为福禄桐遗传多样性分析和亲缘关系等提供理论基础。     

番茄SRAP-PCR反应体系建立与优化

利用正交实验设计L16(45)对番茄SRAP-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶和模板DNA)在4个水平上进行优化试验研究。结果表明:各因素水平变化对反应体系影响的大小依次为:Mg2+dNTPs引物Taq DNA聚合酶模板DNA;建立的番茄SRAP-PCR最佳体系(25μL)为:Mg2+2.5mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5U、dNTPs0.25mmol/L、引物0.4μmol/L、模板DNA 80ng。