一种弓形虫单管套式PCR检测方法的建立及其在奶山羊应用

根据GenBank上发表的弓形虫RH虫株529bp重复序列,设计内、外2对特异性引物,建立一种弓形虫单管套式PCR检测方法,并进行特异性试验、敏感性试验及奶山羊临床样品的检测试验。结果表明,该方法能够扩增出基因片段大小为216bp,与GenBank收录的相关序列同源,而与山羊泰勒虫、微小隐孢子虫、蓝氏贾第虫基因组无交叉反应,该方法能够检测出DNA的最小量为1fg。使用该方法对137份奶山羊血液样品进行了检测,发现有38份为阳性。本研究所建立的方法具有特异性强、敏感性高的特点,可用于奶山羊弓形虫病的诊断,有较高的临床应用价值。     

弓形虫529 bp基因的克隆及序列分析

本研究对安徽猪源弓形虫529 bp重复序列进行了分析,为其分子流行病学研究以及诊断方法的建立奠定基础。首先对病料虫体基因组DNA进行提取,然后对弓形虫529 bp基因进行PCR扩增、克隆、测序并对测序结果进行比对、同源性分析和构建系统进化树。结果显示,PCR扩增产物约为528 bp,与已报道的弓形虫同一基因序列具有高度同源性,与GenBank报道的EF648169.1株同源性最高,达99.5%,且遗传距离最为接近;与其他5株猪源弓形虫比对显示主要突变区域在第31～74位和第100～141位碱基。表明该猪源弓形虫与犬源弓形虫EF648169.1株为姊妹株;本基因序列碱基突变较少,保守性较好,适合作为弓形虫病诊断的靶基因。     

金荞麦内转录间隔区(ITS)的扩增及序列分析

以2份金荞麦为材料,对其内转录间隔区ITS区序列进行PCR扩增,均获得长约700 bp的特异性产物。测序结果表明,金荞麦1号样品包含ITS序列660 bp,金荞麦2号样品包含ITS序列646 bp,在Genebank中的登录号分别为DQ780602和DQ780600。对现有金荞麦ITS的序列比对表明,其同源率为80.2%~93.1%,变异位点主要在ITS1,表现出较丰富的遗传多样性。采用邻接法构建了金荞麦的系统进化树。     

弓形虫棒状蛋白17基因的克隆与序列分析

为研究弓形虫棒状体蛋白17(ROP17)基因的遗传变异,本研究以弓形虫RH株、PRU株和TgC7株为研究对象,首次PCR扩增了其ROP17基因部分序列,将PCR产物纯化后克隆到pMD18-T并测序。将测定的序列与网上下载的弓形虫VEG株、GT1株和ME49株相应序列进行比对,然后用Mega 5.0程序的NJ法和Puzzle 5.2程序的ML法构建系统发育树。结果表明,3株弓形虫分离株的ROP17基因部分序列长度均为1375 bp,A+T含量在49.53%~50.04%之间,3个虫株相应序列的变异碱基数皆小于20个,其变异率为2.3%,氨基酸序列变异率在0~6.11%之间。系统发育结果显示, ROP17基因部分序列能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型的虫株。本研究结果为进一步研究弓形虫ROP17基因的变异及研制弓形虫ROP17基因的亚单位疫苗提供了理论依据。     

10株巨型艾美球虫rDNA-ITS-1部分序列测定与分析

用一对种特异性引物,对国内10株巨型艾美球虫ITS．1区进行PCR扩增,对扩增产物纯化、测序与分析,并用DNAStar软件对所检测的10株巨型艾美球虫与GenBank中的所有巨型艾美球虫的ITS．1相应序列进行系统发生进化关系分析。结果显示,扬州株、龙岩株和福州株的ITS-1部分序列片段长度为152bp,其余各株均为151bp。10株巨型艾美球虫的同源性为90．7％～100％,在构建的系统发生进化树中分成2大系群,凤阳株形成一个单系群,其余9株为另一系群。虫株间的亲缘关系与地理位置不尽一致,与免疫交叉保护力无相关性。     

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS 序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(299 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。     

弓形虫套式PCR检测方法的建立及其在奶山羊中应用

根据Gen Bank上发表的弓形虫529 bp高度重复序列,利用Primer 5.0设计2对引物,优化反应条件,建立一种弓形虫套式PCR检测方法,并进行特异性、敏感性和临床样品的检测试验。结果表明,该方法能针对弓形虫扩增出目的条带,而隐孢子虫、贾第虫均无特异性条带出现;该方法最低能检出模板的量为1.021×10-4mg/L;利用所建立的方法对采自关中某羊场奶山羊的332份血液样品进行检测,检出阳性样品76份,阳性率为21.69%。由此可见,所建立的弓形虫套式PCR检测方法特异性强、敏感性高,可用于临床检测奶山羊弓形虫的感染。     

弓形虫ITS及5.8S序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株，以及国际标准强毒株RH株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5．8SDNA序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析，旨在对国内不同宿主间弓形虫虫株的遗传变异情况进行分析和验证。为分子遗传学和分子诊断学研究提供资料。结果显示：QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的ITS及5．8S序列完全一致。且与GenBank上注册RH株的ITS及5．8S序列也一致；仅实验室传代保存的RH株的ITS2序列与其它4株的ITS2有2个碱基的差异。结果表明ITS可作为分子标记用于弓形虫与其它原虫的种间鉴定。但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。     

两株水牛伊氏锥虫内转录间隔区基因序列的测定与系统进化关系

为研究从水牛分离到的伊氏锥虫广西株和湖北株的分类学地位,对2株伊氏锥虫的核糖体基因内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)基因进行了克隆和测序分析.用CLUSTALXl.83软件多重比对分析了序列差异,应用MEGA4.0软件绘制系统进化树.结果表明,这2株水牛伊氏锥虫的ITS1-5.8S-ITS2 rRNA基因扩增产物分别为1 102 bp和1 095 bp,序列存在多态性,其中广西株的ITS-1序列长为340 bp,ITS-2序列长为582 bp,湖北株的ITS-1序列长为339bp,ITS-2序列长为587 bp.系统进化分析显示,这2株伊氏锥虫分布在同一大枝的不同亚群中.     

刚地弓形虫GRA25基因的克隆及序列分析

本研究旨在对来源于不同宿主和地理分布的22株弓形虫的GRA25基因进行PCR扩增并测序,对获得的GRA25基因序列进行比对,利用MP和ML两种方法对不同分离株的GRA25基因构建系统进化树。利用生物信息学软件将弓形虫RH株的GRA25基因翻译成氨基酸序列,对其编码蛋白的生物学特征进行分析。结果显示,弓形虫GRA25基因序列有2种长度,分别为939和948 bp。序列比对结果显示,GRA25基因在不同虫株间有82个核苷酸变异位点,变异率为0~4.4%。进化分析结果显示,用GRA25基因不能区分弓形虫基因Ⅰ型和Ⅱ型虫株。生物信息学分析预测弓形虫GRA25蛋白含有7个亲水区域,10个α-螺旋,3个β-折叠,8个无规则卷曲和8个潜在的线性B淋巴细胞抗原表位。本研究结果表明,GRA25基因不能作为标记分子区分不同基因型的弓形虫虫株,但可能作为疫苗候选分子研制新型抗弓形虫基因疫苗或表位肽疫苗。     

水牛α-乳清蛋白基因部分序列的测定与分析

根据奶牛α-乳清蛋白基因序列设计引物,用PCR方法扩增并克隆了包含水牛(Bubalusbubalis)α-乳清蛋白基因的5′侧翼序列(709bp)和第1外显子(160)、第1内含子(337bp)和部分第2外显子(73bp)的序列。将该序列与牛的相应序列进行比较表明,尽管具有非常高的同源性(97.6%),但仍然存在一些碱基差异,这些碱基差异导致了一些转录调控因子识别序列的产生或消失以及转录调控因子识别位点之间的距离的变化,这可能是导致这两个物种中该基因表达存在明显表达差异的原因之一。     

驴Zfx基因CDS序列克隆及序列分析

本研究旨在克隆驴Zfx基因CDS序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的牛Zfx基因mRNA序列（登录号：D84097.1）设计特异性引物,利用RT-PCR技术获取驴Zfx基因CDS序列,并对驴Zfx基因CDS区核苷酸序列和蛋白质结构进行生物信息学分析。结果表明,驴Zfx基因CDS区序列长度为2 403 bp,编码800个氨基酸;驴与马、牛、家犬、白犀牛、马鹿、猫、人、绵羊、黑猩猩的Zfx基因CDS区核苷酸序列同源性分别为99.6%、95.0%、95.3%、97.9%、93.5%、94.9%、95.0%、95.7%和94.9%。对驴及其他9种哺乳动物Zfx基因CDS区的核苷酸序列构建系统进化树,结果显示,驴与马亲缘关系很近,与白犀牛的亲缘关系次之;同时又与聚在一类的家犬、猫亲缘关系较近,而与绵羊、牛的亲缘关系稍远。Zfx蛋白理论等电点（pI）为5.19,不稳定系数为42.94,消光系数为35 810,属于不稳定的亲水性蛋白,含有60个磷酸化位点,无信号肽及跨膜结构,属于非分泌蛋白。Zfx蛋白α-螺旋、延伸链和无规则卷曲分别为23.12%、20.25%和56.63%,三级结构主要为α-螺旋和无规则卷曲。本试验成功克隆获得驴Zfx基因CDS序列,为后期深入研究该基因及其编码蛋白的结构功能提供依据。     

miRBase-micro RNA序列数据库

miRBase是集miRNA命名、序列存储、注释、靶标预测和搜索功能于一身的主要在线数据库。使用者可以通过名称、关键词或序列等方式进行检索,并可通过链接查询有关该miRNA的主要文献,对miRNA进行基因组背景分析及靶标预测等。     

家兔MC1R基因5'-侧翼序列的克隆及测序

毛色作为家兔的一种遗传标记,在品种特征、纯度鉴定及品种选育中均具有重要的作用。MC1R基因作为控制动物毛色的重要基因之一,其核苷酸序列多态性与多种动物的毛色表型相关。本试验根据GenBank中已知的兔MC1R基因核苷酸序列(登录号:AM180881)设计引物RMCR₁和RMCR₂,采用PCR-末端加尾法获得了兔MC1R基因5'端930 bp的未知序列,该序列与GenBank数据库中的已知序列同源性为99%。     

Sequence comparison of pigeon circoviruses

The genome sequences of eight pigeon circoviruses (PiCV) were determined and compared with four previously published sequences. The viruses compared were from the USA, five European countries, China and Australia and included PiCVs from racing, feral, ornamental and meat pigeons and a Senegal dove (Streptopelia senegalensis). The 12 PiCV genomes, ranging from 2032 to 2040 nucleotides in length, displayed similar organizations. Pairwise comparisons showed that the genome nucleotide sequence identities ranged from 85.1% to 97.8% and that the amino acid identities of the putative replication associated (Rep) and putative capsid (Cap) proteins displayed ranges of 91.5-99.1% and 73.0-99.3%, respectively. Comparative analyses identified conserved nucleotide sequences within the Rep gene and 3' intergenic regions, which would be suitable for diagnostic PCR primers, and variable amino acid sequences within the capsid proteins, which should be considered when selecting virus isolates for vaccine development.     

5株猪圆环病毒2型全基因克隆和序列分析

为了解广东地区猪圆环病毒2型(PCV2)流行势态及毒株的基因变异情况,从广东珠三角地区疑似断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)患病死亡猪中采集淋巴结,将PCR鉴定为阳性的病料在PK-15细胞上进行增殖培养,成功分离到5株猪圆环病毒2型毒株,分别标记为GD-jm、GD-sz、GD-pz、GD-gj和GD-ss。再从细胞培养物中提取病毒基因组DNA,对5株PCV2分离株全基因组进行PCR扩增并克隆到pMD18-T Simple Vector进行测序,测序结果提交GenBank,登录号分别为JX912914、JX912915、JX945575、JX945576和JX945577。借助相关生物学软件作同源性分析,这5株PCV2基因组长度均为1767 bp,其中3株为PCV2b亚型,2株为PCV2d亚型。     

3株柔嫩艾美耳球虫28SrRNA基因部分序列的扩增与分析

本研究应用PCR技术扩增来自广东的3株柔嫩艾美耳球虫的28S rRNA基因部分序列,并与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫和刚地弓形虫虫株的相应序列进行比对分析。试验结果显示,柔嫩艾美耳球虫3个样品均获得1172 bp的28S rRNA基因部分有效序列,不同虫株序列没有差异,与GenBank^TM登录的柔嫩艾美耳球虫相应序列只有一个碱基差异,显示种内序列高度保守,而与堆型艾美耳球虫、鼠肉孢子虫、刚地弓形虫相应的序列存在不同程度的差异。结果表明,28S rRNA基因部分序列可作为研究艾美耳球虫种间及其他顶复门原虫遗传变异的标记。     

猪瘟流行毒E2基因部分编码序列的分析与比较

利用PCT-PCR方法获得16个猪瘟流行毒株、5株弱毒疫苗株和外来的4株猪瘟E2基因部分编码序列的扩增片断，并对其进行测序，获得659bp含E2基因N段A、B、C、D四区域的编码序列。利用DNAstar软件对其中616bp的片段进行序列分析，并与Genebank中的Alfort、Brescia、HCLV、Shimen等毒株进行比较．结果20株病毒所测序列均为猪瘟E2基因序列，所有毒株碱基替换随机分布于整个序列．部分毒株出现碱基缺失现象。序列分析结果表明近期流行的毒株不仅与50年代流行的Shimen株、现用的疫苗株距离较远，而且流行毒株呈不同亚群方向演变。本研究所测的20株流行株E2基因N端6个与C端的2个半胱氨酸(Cys)均未发生变异．但其他位点的核甘酸变异与缺失．引起各区的抗原表位呈现不同程度的变异。     

猪瘟野毒不同代次E2基因主要抗原编码区序列差异分析

利用RT－PCR及序列测定对5株猪瘟野毒14个不同代次毒株E2基因主要抗原编码区序列进行了分析。结果表明每个野毒的不同代次毒株核苷酸及氨基酸序列均呈现较高的保守性，核苷酸及氨基酸序列均无变化，核苷及氨基酸同源性均为100%。与02号野毒相比，其他4株野毒核苷酸及氨基酸同源性分别为82.0%-99.5%、84.1%-98.6%。遗传衍化分析结果表明所有毒株被分成2个基因组，每个基因组又分成2个基因亚组。03、05和22号毒株位于第一基因组，02、06号毒株位于第二基因组。每一个毒株的不同代次毒株均位于同一基因组、同一基因亚组。证实了猪瘟病毒分子结构的遗传稳定性。     

副猪嗜血杆菌thyA基因的序列分析

为探究副猪嗜血杆菌thyA基因的遗传特性,针对于分离的副猪嗜血杆菌辽宁分离株的thyA基因进行测序,并运用软件对基因序列及氨基酸序列的同源性等进行分析研究。结果显示,thyA基因在副猪嗜血杆菌辽宁株亲缘性较高,其中基因序列与已公布的参考菌株同源性为95.7%~100%,氨基酸序列同源性为97.2%~100%,预测thyA基因编码蛋白的三级结构,发现thyA毒力基因在副猪嗜血杆菌中保守存在,为揭示thyA基因在副猪嗜血杆菌中功能奠定了一定基础。