海滨雀稗以hpt与bar基因为筛选标记的转化体系比较研究

海滨雀稗作为耐盐性较强的暖季型草坪草,具有极大的应用潜力。为建立高效稳定的海滨雀稗遗传转化体系,本研究以海滨雀稗成熟种子为外植体,确定了筛选剂潮霉素和草丁膦在海滨雀稗的愈伤组织继代培养和再生阶段的最佳筛选压。在进一步优化遗传转化条件的基础上,比较了以hpt与bar基因作为转基因筛选标记对海滨雀稗农杆菌介导的遗传转化效率的影响。结果表明：愈伤组织的再生率在继代36周后显著下降,继代48周的最高再生率为67.9%。潮霉素的最佳筛选压在继代培养阶段为120 mg·L^-1,再生阶段为80 mg·L^-1。草丁膦的最佳筛选压均为1.2 mg·L^-1。选取继代24周的愈伤组织用于农杆菌介导的遗传转化,最佳的转化条件为菌液浓度OD600=0.6,添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮和0.01%的Silwet L-77,并辅以超声波处理20 min或真空处理10 min,浸染30min后共培养2 d。通过多次抗性愈伤组织和抗性再生苗的筛选,2种载体均获得了转基因再生植株。通过PCR检测证明hpt和bar基因分别成功在...     

海滨雀稗耐逆性研究进展

海滨雀稗（Paspalums vaginatium）作为最耐盐的暖季型草坪草,具有耐盐性强、景观效果佳、耐粗放管理等优点,被广泛应用于高尔夫球场、足球场和景观绿地的建植中,在盐碱地的植物修复改良中具有巨大的应用潜力。海滨雀稗的耐盐性极强,但品种间的耐盐性存在较大差异。在耐盐机理研究方面,主要集中于盐胁迫下的形态学、离子吸收、渗透调节和光合作用影响等方面,对关键耐盐基因在耐盐调控中的研究较少。海滨雀稗的耐寒性和耐旱性相对较差,且不同品种间存在较大差异,这严重限制了海滨雀稗在我国北方干旱盐碱地区的推广应用。本文就海滨雀稗的耐逆性评价及耐逆机理等方面的研究进行综述,旨在为海滨雀稗耐逆机理研究和耐逆新品种选育工作提供借鉴,以期为农作物的耐盐性研究提供理论基础和基因来源。     

龙爪茅与海滨雀稗抗寒性比较

以海南野生海滨雀稗和海滨雀稗育成品种Salam作对照,对龙爪茅的抗寒性进行了评价。在实验室模拟秋冬季温度条件下,测定了龙爪茅及海滨雀稗的相对电导率（REC）,氧化物歧化酶（SOD）活性和二醛（MDA）含量的变化,并在南京田间条件下观测了各材料越冬期间的枯黄率。结果显示,25～5℃温度处理,各材料基本不受伤害,REC,SOD活性和MDA含量变化不明显。5-0℃条件下,各材料REC基本不变,但SOD活性下降,MDA含量增加。0--16℃条件下,各材料随温度的降低,REC迅速增加,SOD活性迅速降低,而MDA含量升高。通过拟合Logistic方程分析,龙爪茅,海南野生海滨雀稗和Salam的LT5。分别为-4．2,8．0和-8．1℃。田间自然条件下各材料自10月26日开始逐渐表现出枯黄,其枯黄速度龙爪茅最快,海南野生海滨雀稗次之,Salam最慢。结果表明,龙爪茅耐寒性逊于海滨雀稗,其草坪利用需要进行耐寒性方面的驯化选育。     

海盐胁迫对海滨雀稗生长及植株体内阳离子含量的影响

将0、6.8、13.6、20.4、27.2和34 g/L的海盐同1/2Hoagland营养液混合用作灌溉处理,研究海盐胁迫对海滨雀稗Paspalum vaginatum生长及植株体内Na+、K+、Ca+、Mg+含量的影响。结果表明,海滨雀稗生长受海盐处理抑制,其抑制程度随海盐质量浓度的增加而加大。茎和叶中Na+含量随海盐质量浓度增高而升高,在海盐质量浓度34 g/L时,分别为23.35和22.27 mg/g;根中Na+含量在海盐质量浓度为6.8 g/L时与对照差异不显著,其他处理均显著高于对照和6.8 g/L的处理。叶中K+含量不随海盐胁迫而变化,维持在25 mg/g左右;茎中K+含量随海盐质量浓度增加逐渐降低,根的K+含量在20.4 g/L达到最大值6.4 mg/g,在34 g/L时反而降低,但高于对照。海滨雀稗耐盐的原因之一可能是叶片中K+含量稳定。     

秋水仙素诱导获得自交结实的海滨雀稗体细胞突变体

以海滨雀稗Adalayd幼穗离体诱导获得的胚性愈伤组织为材料,在愈伤组织继代培养基中添加500~2000 mg/L秋水仙素,诱变处理24,48和72 h后,离体筛选得到浅黄色颗粒状愈伤组织在分化培养基上再生出植株,再生植株结实性调查结果显示,获得的1960株不同秋水仙素处理的再生植株和688株原始对照组织培养再生植株中,经1000 mg/L秋水仙素诱变处理24 h获得的2个单株上分别收获了4和3粒种子,500 mg/L秋水仙素诱变处理24 h获得的1个单株上收获到1粒种子;3个单株上收获的M₁种子各取1粒播种于盆体,均可发芽成坪,分别记为SP2008-1、SP2008-2 和SP2008-3,M₁种子苗上分别收获到了自交结实的M₂代种子253,38和45粒,种子千粒重分别为0.471,0.440和0.496 g。染色体计数结果表明,SP2008-1和SP2008-2染色体数2n=20,与原始对照Adalayd染色体数目相同,为二倍体;SP2008-3的染色体数为20和40条的分别占86.7%和13.3%,是二倍体和四倍体的嵌合体。RAPD检测结果表明,SP2008-1、SP2008-2和SP2008-3在分子水平上均与对照Adalayd存在差异,为自交结实型海滨雀稗体细胞突变体。     

假俭草和海滨雀稗对土壤铅污染胁迫的生理反应

通过盆栽试验研究了假俭草Eremochloa ophiuroides和海滨雀稗Paspalum vaginatum2种草坪植物在3 000和6 000 mg/kg铅浓度胁迫下的生理变化。结果表明,2种草坪植物在不同铅浓度胁迫下呈现明显的差异。在3 000 mg/kg铅浓度胁迫下,假俭草的叶片叶绿素含量、光化学效率和渗透势均未出现显著(P0.05)变化;处理后12 d叶片电导率显著上升,24 d叶片相对含水量显著下降;目测质量虽然在4 d时即开始显著下降,但在整个试验期间仍维持在可接受草坪质量(6.0)之上。在6 000 mg/kg铅浓度胁迫下,假俭草的所有生理指标在4 d即出现显著变化,12 d植物完全枯死。在3 000 mg/kg铅浓度胁迫下,海滨雀稗的叶片光化学效率、渗透势、叶绿素含量不仅没有下降,反而分别于12、16和24 d显著高于对照;电导率和草坪目测质量则与对照无显著差异(P0.05);叶片相对含水量虽然在12 d时出现显著下降,但在24 d时又恢复到了对照水平。在6 000 mg/kg铅浓度胁迫下,海滨雀稗的叶绿素含量未出现显著下降;叶片电导率在4 d即开始显著上升,渗透势、相对含水量和光化学效率在4 d显著下降,但分别于12、16、20和24 d恢复到对照水平;草坪目测质量虽然低于对照,但仍维持在可接受草坪质量之上。上述结果说明海滨雀稗在6 000 mg/kg浓度的土壤铅污染下仍能修复铅污染带来的伤害,其耐铅性要显著高于假俭草。     

金沙湾乡村俱乐部海滨雀稗草坪杂草及化学控制技术研究

 本研究于２００６－２００８年在江苏金沙湾乡村俱乐部进行,明确该球场有草坪杂草２９科９５种,其中禾本科１９种,莎草科３种,阔叶草２７科７３种。其中春季萌发的有５０种,秋季萌发的３６种,春、秋季都萌发的９种。建场初,杂草种类仍保留原生态系的痕迹,经过草坪管理特别是剪草及应用除草剂,杂草种类转为以草坪伴生杂草为优势种。田间杂草化学防除试验表明,砜嘧磺隆（Ｒｉｍｓｕｌｆｕｒｏｎ,ｎ ｛［（４,６-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-２-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｃａｒｂｏｎｙｌ｝-３-（ｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）-２-ｐｙｒｉｄｉｎｅｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ）０．０４５～０．０３０ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 与嗪磺隆［Ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ,１-２-ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ-３-（４-ｍｅｔｈｏｘｙ-１,３,５-ｔｒｉａｚｉｎ-２-ｙｌ）ｕｒｅａ］０．０２００～０．０２２８ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 混配秋季在海滨雀稗应用,药后６１和１１５ｄ,对禾草和阔叶草防效为６５．４％～９４．８％。氯吡嘧磺隆（Ｈａｌｏｓｕｌｆｕｒｏｎ ｍｅｔｈｙｌ,ｍｅｔｈｙｌ５-｛［（４,６-ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ-２-ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｃａｒｂｏｎｙｌａｍｉｎｏｓｕｌｆｏｎｙｌ｝-３-ｃｈｌｏｒｏ-１-ｍｅｔｈｙ-ｌ １Ｈ-ｐｙｒａｚｏｌｅ-４-ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）０．０３７５～０．０５２５ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 与砜嘧磺隆０．０４５～０．０３０ｋｇａｉ／ｈｍ２ 混配秋季在海滨雀稗应用,药后４９和１０３ｄ,对多年生黑麦草、一年生早熟禾防效为６９．４％～７１．２％。砜嘧磺隆０．０６ｋｇａｉ／ｈｍ^２、氯吡嘧磺隆０．０６７５ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 及嗪磺隆０．０２２８ｋｇａｉ／ｈｍ^２对建植１年的海滨雀稗（品种：Ｓａｌａｍ）生长无影响或甚微,砜嘧磺隆０．１８ｋｇａｉ／ｈｍ^２ 药后２～４周对海滨雀稗有可见影响,直到药后３６周才恢复。     

海滨雀稗~(60)Co-γ辐射诱变突变体筛选

海滨雀稗具有耐盐、对灌溉水质要求不高的特性。用它建植的草坪可以降低淡水资源的消耗和浪费,但目前我国还没有自己育成的海滨雀稗品种,只能通过国外引进。本实验以海滨雀稗4个品种Sea Isle 2000、Platinum、Supreme、Salam为材料,利用~(60)Co-γ射线以0.12Gy/min的强度在0,40,45,50,55Gy 5个剂量下分别照射种茎,从辐照群体中寻找突变材料,对突变材料从叶宽、叶长、株高、匍匐茎节间长度和直径以及密度等坪用性状进行观测分析,研究其植株形态变异的诱变效应,并从中选育性状优良的突变材料。结果表明,材料经辐射后,不同海滨雀稗品种对~(60)Co-γ辐射的敏感性不同。经过3个阶段的扩繁、筛选,Sea Isle 2000选出3个突变体,Platinum选出3个突变体,Supreme选出1个突变体,Salam选出2个突变体,初步共选育出9个突变材料。所有突变材料的植株叶宽、叶长、株高、匍匐茎节间长度和直径以及密度等指标均不同程度地优于各自对照。综合来看,突变材料"SI-50-1"、"PL-40-2"、"SLM-45-1"叶片短细、节间缩短、株高矮化、成坪密度高,辐射诱变效果最明显,为新品种选育提供了优异的育种新材料。     

基于高通量测序的海滨雀稗转录组学研究

采用新一代高通量测序技术Illumina HiSeq 2000对海滨雀稗叶片转录组进行测序,结合生物信息学方法开展基因表达谱研究和功能基因预测。通过测序,获得了47520544个序列读取片段(reads),包含了4752054400个碱基序列(bp)信息。对reads进行序列组装,获得81220个单基因簇(unigene),平均长度1077 bp,序列信息达到了87542503 bp。另外从长度分布、GC含量、表达水平等方面对unigene进行评估,数据显示测序质量好,可信度高。数据库中的序列同源性比较表明,46169个unigene与其他生物的已知基因具有不同程度的同源性。海滨雀稗转录组中的unigene根据GO功能大致可分为细胞组分、分子功能和生物学过程三大类48个分支,其中有大量unigene与代谢进程、结合活性和细胞进程相关。将unigene与COG数据库进行比对,根据其功能大致可分为25类。KEGG 数据库作为参考,依据代谢途径可将unigene定位到112个代谢途径分支,包括苯丙氨酸代谢通路、植物与病原物互作、植物激素生物合成和信号转导、黄酮类化合物合成、萜类骨架生物合成、脂类代谢、RNA降解等。SSR位点查找发现,从81220个unigene中共找到22721个SSR位点。SSR不同重复基序类型中,出现频率最高的为A/T,其次是CCG/CGG和AGC/CTG。本研究首次对海滨雀稗转录组进行了分析,为草坪草的分子生物学研究提供了宝贵的基因组数据来源。     

白羊草成熟胚组织培养及植株再生体系的建立

以白羊草(Bothriochloa ischaemum(L.)Keng)成熟胚为外植体,研究不同激素及其不同配比对愈伤组织诱导发生与生长状态及其绿苗分化能力的影响。从而建立了白羊草植株再生体系,为开展生物技术育种提供参考。结果表明:在愈伤组织诱导培养基中添加2.0 mg/L 2,4-D诱导频率为86.7%,MSB和MS培养基对愈伤组织诱导效果相近;在其继代培养基中添加1.0 mg/L 2,4-D愈伤组织增殖快,且保持胚胎发生能力;适宜的分化培养基为6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L,分化率达61.3%;愈伤组织在不添加任何生长调节剂的培养基上即可生根。     

海雀稗幼穗离体培养植株再生

本研究旨在离体培养条件下建立起海雀稗植株再生的技术体系,为开展海雀稗细胞和分子生物学育种工作创造条件。以Adalay海雀稗(Paspalum vaginatum Sw.cv.Adalay)的幼穗为外植体材料,在附加2,4-D 2.0~4.0 mg/L稍作修改的MS培养基上,愈伤组织诱导率达90%以上。不同发育时期的幼穗影响其愈伤组织的诱导发生频率:1.0~2.0 cm长的幼穗,愈伤组织诱导率达80%以上;2. 0 cm以上的幼穗,诱导率降至60%以下。在添加2,4-D2.0 mg/L和BAP 0.05 mg/L的愈伤组织诱导培养基上,诱导产生的颗粒状愈伤组织占愈伤组织总数的40%以上。愈伤组织继代培养基中琼脂的用量提高到16 g/L时,愈伤组织在继代培养过程中保持颗粒状结构。颗粒状愈伤组织经连续继代培养3次后转移到附加BAP 2.0 mg/L的分化培养基上,植株再生频率达98%。通过提高愈伤组织继代培养基的渗透压,海雀稗幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织在继代培养过程中能够保持颗粒状的结构和高频率植株再生的能力。     

海雀稗体细胞低温筛选获得耐寒突变体

旨在细胞水平上建立海雀稗(Paspalum vaginatum Sw.)低温胁迫定向筛选耐寒突变体技术,为开展海雀稗耐寒品种选育提供新途经。于2008年1月以海雀稗Adalay品种(P.vaginatum cv.Adalay)的幼穗诱导产生的颗粒状愈伤组织为材料,分别在6℃和0℃低温条件下进行培养和筛选。试验结果:在6℃和0℃下,培养30 d,愈伤组织的绿苗分化率均在80%以上,比对照处理(培养温度26℃)绿苗分化率略有下降;培养45 d,绿苗分化率分别为60%和50%;培养60 d,绿苗分化率分别降至33%和23%。在0℃下培养75 d,愈伤组织完全丧失分化植株的能力;0℃培养0、30、45和60 d的再生植株叶片的半致死温度分别为:-5.69℃、-6.07℃、-6.35℃和-6.63℃。SRAP分子标记测定结果显示,特异性SRAP标记与海雀稗体细胞突变体的耐寒性相关。海雀稗颗粒状愈伤组织在0℃下培养和筛选45 d和60 d获得了耐寒突变体植株。     

海雀稗SRAP-PCR分子标记体系优化及引物筛选

以4个代表性海雀稗（Paspalum vaginatum）种质的叶片DNA为模板,采用L₉（3⁴）正交试验设计,对影响海雀稗SRAP-PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行了优化,并比较了不同浓度模板DNA对扩增的影响,以确定适合海雀稗的SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明：海雀稗SRAP-PCR最佳反应体系为10×PCR buffer 1 μL、模板DNA50 ng、Mg²⁺2.5 mmol·L^-1、dNTP150 μmol·L^-1、引物0.4 μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶1.0 U,总体积10 μL。利用该反应体系从100对引物中筛选出可扩增清晰条带的引物83对,在83对引物中选出多态性丰富的引物44对。SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选,为今后利用SRAP标记技术进行海雀稗遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种提供技术支持。     

扁穗牛鞭草再生体系的建立

以‘雅安'扁穗牛鞭草(Hemarthria compressa)的幼茎和幼叶为外植体,通过胚性愈伤组织建立扁穗牛鞭草的高效再生体系。结果表明:幼叶比幼茎更适合建立再生体系,最佳诱导培养基为MS+2,4-D 1.0 mg·L~(-1),幼叶和幼茎的出愈率分别为100%和86.96%。最佳分化培养基和不定芽增殖培养基均是MS+6-BA 1.0 mg·L~(-1)+NAA 0.2 mg·L~(-1),愈伤分化率分别为100%和72.90%,再生苗增殖系数可达18.6。1/2 MS是最适宜的生根培养基,生根率达100%。     

多年生黑麦草高频再生体系的建立及优化

从外植体预处理方式、基本培养基、激素浓度等方面着手,对多年生黑麦草愈伤组织诱导、继代、不定芽分化及再生过程中的影响因素进行了研究,提高了再生频率。结果如下：切取胚端半粒种子,经75%乙醇处理1min,0.1%HgCl处理15min,在经无菌水清洗4～6次后接种方式较好;愈伤组织诱导培养基以MS＋2,4—D 8.0 mg/L（或另添加甘露醇25 g/L）为佳;愈伤组织接种于MS＋2,4—D 8.0mg/L＋甘露醇25 g/L上进行1～2次继代后于NB＋6—BA2.0 mg/L上进行分化;不定芽转接至MS＋6—BA2.0 mg/L上进行扩繁或于1/2MS＋NAA0.5mg/L＋IAA0.5mg/L上进行生根。     

苜蓿外植体再生系统的建立研究

以5个品种的下胚轴、叶片和子叶为外植体研究了不同培养基、不同激素种类和配比以及脯氨酸、谷胱甘肽和蔗糖对苜蓿胚性愈伤组织和胚状体诱导、成苗和移栽的影响,结果表明:中苜1号叶片外植体胚性愈伤组织诱导率和胚状体诱导率最高;最佳胚性愈伤组织诱导培养基为改良SH+2,4-D4.0mg·L-1+BA0.5mg·L-1;最佳胚状体诱导和成苗培养基均为MSO;脯氨酸对胚状体诱导无明显作用;谷胱甘肽为15mg·L-1、蔗糖为2%时诱导率最大。筛选出的5个基因型的胚状体诱导率为58%～77%,平均胚状体数目25～60个,胚状体再生率16%～72%,生根率为93%,移栽成活率为94%。另外,还建立了苜蓿高频再生组织培养体系,为今后的基因转化改良苜蓿性状打下了基础。     

野生甘蒙锦鸡儿的组织培养研究

本试验采用甘蒙锦鸡儿（Caragana opulens Kom.）成熟种子为材料,利用组织培养的方法进行成熟胚的诱导,当胚成苗后进行增殖和生根培养,建立了一套野生甘蒙锦鸡儿的组培体系,为保护甘蒙锦鸡儿野生资源及其引种到城市园林建设中提供一定的借鉴作用。结果表明：试验前将种子用蒸馏水浸泡一晚效果较好;当灭菌时间为15 min时污染率最小,为37.61%;MS+6-BA 0.5 mg·L^-1+NAA 0.05 mg·L^-1培养基为最适宜成熟胚离体诱导的培养基;MS+6-BA 0.5mg·L^-1+NAA 0.05 mg·L^-1培养基为最适宜增殖的培养基;再生苗移植到1/2 MS+IAA 0.1 mg·L^-1培养基上,植株健壮,生根率为63.16%;将生根培养的甘蒙锦鸡儿幼苗移栽到草炭土：珍珠岩：蛭石=6：3：1的混合基质中,成活率为90%。     

外源水杨酸对低温胁迫下海滨雀稗抗寒生理特征的影响

为探讨水杨酸(SA)对海滨雀稗耐寒性的影响,以海滨雀稗“白金”品种为材料,分析了外源水杨酸(1 mmol·L^-1)预处理对适温(30 ℃/25 ℃,昼/夜),冷害(8 ℃/4 ℃)和冻害(2 ℃/-2 ℃)3种温度处理下海滨雀稗生长速率和草坪质量、叶片电导率(EL)和丙二醛(MDA)含量、抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性、脂肪酸含量及脂肪酸不饱和指数的影响。结果表明,在冷害和冻害下,草坪质量下降,叶片EL增大,MDA含量升高,叶片SOD、POD和CAT活性升高;而外源SA预处理显著缓解低温对海滨雀稗草坪质量的伤害,降低叶片EL和MDA含量,提高SOD、POD和CAT活性。低温下叶片不饱和脂肪酸含量升高,饱和脂肪酸含量下降,而外源SA预处理将进一步显著提高不饱和脂肪酸的含量和脂肪酸不饱和指数。因此,外源SA预处理显著提高冷害和冻害胁迫下海滨雀稗叶片的不饱和脂肪酸含量和不饱和指数,从而维持低温胁迫下细胞膜的稳定性,增强抗氧化能力,缓解低温对植株的伤害而提高耐寒能力。