猪瘟病毒保护性抗原E2基因的克隆及在原核细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ分两段扩增猪瘟病毒（ＨＣＶ）石门株Ｅ２基因,然后对其进行了克隆。利用两个片段重叠部分的单一ＢｇｌⅡ位点,将它们连接成为完整的Ｅ２基因,并克隆到ＰＵＣ１９质粒中,获得重 质粒ＰＨＣＦ２。另设计一对引物,以ＰＨＣＦ２为模板扩增出不含信号肽的Ｅ２基因,然后将其克隆到表达载体质粒ｐＢＶ２２０和ＰＥＴ＿２８ａ（＋）中,获得重组质粒ＰＢＶＥ２和ＰＥＴＥ２,用酶切,ＰＣＲ和序列分析鉴定Ｅ２基因插     

猪瘟病毒石门株E2基因的RT-PCR克隆及鉴定

本文采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从感染猪血中成功扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株Ｅ２基因,大小为１１８４ｂｐ,与预期大小一致。经巢式ＰＣＲ和酶切鉴定证实所扩增的片段为Ｅ２基因特异性片段。将扩增的Ｅ２基因克隆到Ｐ＾ＧＥＭ－Ｔ载体,采用限制性内切酶鉴定和ＰＣＲ技术了阳性重组子。     

猪瘟病毒E2基因的克隆与鉴定

根据猪瘟病毒Brescia株全基因序列设计合成特异性引物对P1/P2对，采用异硫氰酸胍一步法（略加修改），从PK15细胞培养物中提取石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株猪瘟病毒的总RNA。应用RT-PCR方法成功地扩增出E2全基因组约1273bp的cDNA片断，经电泳证明其大小与推测相符。分别将石门株、兔化弱毒疫苗株、野毒03株及野毒07株的E2基因片段克隆到pGEM-T载体质粒，通过对这4个重组质粒的EcoRI酶切鉴定、直接与套式PCR扩增，并对E2主要抗原区域进行224bp的序列测定，表明E2全基因克隆成功，为E2全序列测定和结构与功能的分析奠定了基础。     

猪瘟病毒分离株E2基因的克隆与酵母表达系统转移载体的构建

用猪肾细胞 (PK- 15 )繁殖猪瘟病毒 (CSFV)分离株 HL - L Y,根据基因库已发表的 CSFV E2 基因序列 ,设计并合成一对引物 ,以 CSFV总 RNA为模板 ,通过 RT- PCR技术扩增出约 1.1kb的片段 ,即 E2 基因。将 RT- PCR产物先克隆到 p MD18- T载体上 ,构建了重组质粒 T- E2 ,再通过双酶切亚克隆到表达载体 p PIC9的多克隆位点 (MCS)上 ,经酶切、PCR鉴定和测序分析 ,表明均已成功获得了 CSFV E2 基因的重组体 p PIC9- E2 。将该测序结果与国内几个毒株 SHIMEN,C,C- V- L Z,GS- L T,GS- L X分别进行序列同源性比较 ,核苷酸同源性分别为 96 .5 1% ,95 .5 3% ,89.12 % ,78.6 6 % ,77.2 3% ;氨基酸同源性分别为 97.32 % ,95 .71% ,89.5 4 % ,83.16 % ,83.4 2 %。表明该毒株与国内标准毒株 SHIMEN株和 C株具有较高的同源性     

猪瘟病毒Shimen株E2基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建

根据已发表的猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）Shimen株的全基因组序列，设计2对引物P1／P2和B1／B2，在B1和B2的5’端分别加上EcoR 1和BamH 1位点，以CSFV—Shimen株脾毒为材料。一步法提取总RNA。并以此为模板采用反转录PCR（RT—PCR）和套式PCR（nPCR）。成功地扩增出约1．2kb的E2基因。将PCR产物回收后与pMD18-T载体连接并转化。经PCR和酶切鉴定获得重组质粒E2-T。将E2-T经EeoR 1和BamH 1酶切消化、回收目的基因后。与经BamH 1／EcoR 1酶切的逆转录病毒载体pBABE—puro连接并转化，经酶切鉴定获得重组质粒pBABE—puro—E2。序列测定表明，目的基因的插入位置、方向和读码框完全正确。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达

为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白,并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性,为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段,运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体,构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清,通过间接ELISA方法测定抗体水平,间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示,37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下,E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达,经纯化复性后免疫小鼠,制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白,制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。     

猪瘟病毒贵州流行株E2基因原核表达及其免疫原性的研究

本研究根据GenBank登录的猪瘟病毒Shimen和C株的E2基因序列设计1对特异引物,采集来自贵州的疑似猪瘟病死猪组织,提取总RNA,进行RT-PCR扩增,将扩增产物测序后进行核苷酸序列比较分析.并将RTPCR产物克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒pMD18-T-E2,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将E2基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,成功构建猪瘟病毒E2基因原核表达质粒pET-32a-E2,将构建好的原核表达质粒pET-32a-E2转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot分析,得到了约58 ku的条带,与预期大小相符,进一步提取、纯化目的蛋白,将目的蛋白加入弗氏佐剂免疫小鼠,免疫后采血检测抗体,结果显示目的蛋白能诱导小鼠产生一定抗体水平,该研究为猪瘟亚单位疫苗的研究奠定了基础.     

猪瘟病毒E2基因的克隆及分子特性分析

为研究四川地区猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）及E2基因的遗传变异情况,试验对CSFV阳性病料抽提RNA,通过RT-PCR扩增CSFV E2基因并将其克隆到pMD18-T载体,经菌落PCR、双酶切、序列测定后利用生物信息学软件分析了E2基因的分子特性。结果显示,扩增的E2基因大小为1 125 bp,编码375个氨基酸,与GenBank中CSFV GXWZ02、CSFV/2.1、HEBZ、YC11WB、SXYL2006、0406/CH/01/TWN亲缘关系较近,核苷酸同源性分别为98.3%、96.5%、94.7%、92.4%、92.1%和90.9%,而与疫苗株HCLV E2的同源性较低,为87.6%。密码子偏向性分析显示,E2基因的ENc值为53.161,密码子使用频率与大肠杆菌、酵母菌和人差异较大的分别有33、25和25个;此外,E2基因共有34个稀有密码子,且有多个稀有密码子多次串联成簇的情况出现。结果表明,E2基因在密码子使用中整体上不存在较明显的偏向性,且密码子使用模式更接近真核生物,本试验克隆的E2基因与疫苗株相比,部分核苷酸出现了变异,但主要抗原域氨基酸未发生改变,该结果为进一步开展CSFV E2功能研究及后期基因工程苗的研制提供了基础数据。     

猪瘟病毒非结构蛋白NS2基因不同片段的克隆及在原核系统中的高效表达

参照猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株（HCLV）的基因组序列，设计并合成一组引物。从已构建含有猪瘟病毒兔化弱毒株全基因组质粒pMCfT1—6中分别扩增出NS2长1389bp和876bp的片段。将扩增的不同长度的NS2基因序列克隆至表达载体pGEX—KG中，经酶切鉴定后，转化大肠杆菌BL21（DE3），于37℃，1．0mmol／L IPTG条件下诱导表达。大肠杆菌菌体裂解产物经SDS—PAGE分析，在分子量约为40ku处出现和预期的目的蛋白分子量相符的条带。Western—blotting检测表明，表达产物能与猪瘟病毒阳性血清发生特异性反应，出现单一反应带，该表达产物主要存在于包涵体中。上述结果为NS2基因表达产物在免疫检测中的进一步应用奠定了基础。     

猪瘟病毒的分离鉴定及其E2基因序列分析

2004~2005年上海和江苏3家猪场发生仔猪急性死亡,用ELISA鉴别试剂盒证明为猪瘟感染。用PK15细胞分离病毒,传代至第3代无细胞病变,RT-PCR扩增E2基因为阳性,扩增片段经纯化后克隆入T载体并进行序列测定。通过DNAStar软件对3株病毒的基因序列进行了比较,同时构建了系统进化树,结果表明,三株病毒分离株均扩增出269bp片段并且核苷酸序列100%同源,这3株与Alfort、Shimen株、兔化弱毒株(HCLV)和Brescia4个标准毒株核苷酸序列同源性均在90%以上,说明在江苏、上海地区分离得到的3株猪瘟病毒与流行毒株在基因序列上没有发生大的变异。     

猪瘟病毒E2基因和牛疱疹病毒Ⅰ型UL49基因的共表达

为了探讨牛疱疹病毒Ⅰ型（BHV—1）UL49基因编码的膜蛋白VP22对猪瘟病毒E2基因表达水平的影响，构建了单独表达E2蛋白的pcDNA3．1-E2及融合表达E2-VP22的pcDNA3．1 E2-UL49。将pcDNA3．1-E2与pcDNA3．1-E2-UL49分别转染293T细胞，间接免疫荧光试验结果显示，单独表达E2蛋白的细胞，其荧光主要固缩于核周，而融合表达E2-VP22蛋白的细胞在核周及细胞质内都有大量的荧光；Western-blot分析结果显示，VP22蛋白与E2蛋白都获得了表达．但融合了VP22蛋白的E2蛋白表达量要相对高一些（P〈0．01），表明VP22蛋白可以促进E2蛋白的表达。     

多次传代和致细胞病变猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列，设计合成了2对引物，以脾毒和细胞毒总RNA为模板，利用反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）、套式聚合酶链式反应（nPCR）及测序技术，对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒的主要外膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定，用DNA star软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现，脾毒和标准石门株的核苷酸序列同源性为99．4％，氨基酸序列同源性为99．0％，细胞毒标准石门株的核苷酸序列同源性为98．3％，氨基酸同源性96．7％。由此说明猪瘟病毒经猪多次传代和致细胞病变后均保持遗传的稳定性。     

山西猪瘟野毒株E_2基因序列测定与遗传变异多样性分析

为了解山西地区猪瘟病毒（CSFV）流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法,2013年从山西部分地区分离出5株CSFV流行毒株,并进行了E2全基因扩增、克隆与序列测定,应用DNAStar分析软件对所测定的5株毒株与国内外参考毒株的相应序列进行了同源性分析,绘制系统发育进化树。结果表明：5株CSFV流行毒株之间E2基因核苷酸序列与所推导氨基酸序列的同源性分别为81.4%~100%和87.9%~100%,与CSFV石门毒株（Shimen株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为82.9%~94.8%和89.0%~94.9%,与CSFV兔化弱毒株（HCLV株）的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.6%~99.6%和87.9%~99.5%,与17株来自各国不同地区的CSFV参考毒株的核苷酸与氨基酸的同源性分别为81.5%~99.6%和86.3%~99.7%。经系统发育关系分析,4株属于基因2群,且705、713、725、729、734和738位氨基酸发生置换,另外1株属于基因1群。本研究揭示了山西猪瘟流行毒株的遗传变异多样性现状。     

猪瘟病毒E2糖蛋白A1抗原亚区的表达

猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2存在4个不同抗原区(A-D)，根据中和特性和保守性差异，将A抗原区进一步划分为A1、A2、A3抗原亚区，A1抗原亚区在不同猪瘟病毒分离毒株中高度保守且诱导的单克隆抗体具有中和特性。本采用pRSET C载体，对A抗原区2744nt～2947nt(791aa～858aa)基因片段(EC)进行克隆、表达，并分析表达产物的免疫反应性。研究发现：EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410发生特异性结合，且此结合能被猪瘟病毒抗原或阳性血清阻断。结果表明：A1抗原亚区位于E2蛋白791～858位氨基酸区域。     

猪瘟病毒E0和E2蛋白融合表达的重组腺病毒构建及免疫保护性研究

为评价重组腺病毒融合表达猪瘟病毒(CSFV)E0和E2蛋白的免疫保护效果,本研究以CSFV基因组为模板,应用RT-PCR扩增E0和E2蛋白的编码基因,通过pET-32a载体将E0和E2基因串联,形成pET-E0-E2重组质粒。用KpnⅠ和NotⅠ双酶切pET-E0-E2得到E0-E2融合基因,定向亚克隆于穿梭载体pAdTrack-CMV中,采用"两步转化法"在细菌内同源重组,构建携带E0-E2基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E0-E2,经PacⅠ酶切线性化后转染人胚胎肾细胞(HEK293),成功包装出重组腺病毒(rAd-E0-E2),PCR和western blot检测表明,E0-E2基因已重组于腺病毒基因组中并获得表达。将rAd-E0-E2接种于小鼠和猪,并通过ELISA进行抗体检测。另外,将rAd-E0-E2经肌肉2次(间隔7d)免疫接种6周龄～7周龄猪,3周后用103TCID50CSFV石门株攻毒。结果表明,rAd-E0-E2免疫组6/7头存活,各组织器官带毒时间不超过10d,而非重组腺病毒rAd-CMV免疫组和空白对照组全部死亡,各组织器官均能分离到CSFV。结果提示,rAd-E0-E2能使免疫猪抵抗CSFV强毒攻击,为进一步研制猪瘟基因工程疫苗提供了实验依据。     

猪瘟病毒重组E2蛋白PPA-ELISA抗体检测试剂盒的研制及应用

以纯化的猪瘟病毒（CSFV）重组E2蛋白为包被抗原,辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白为二抗,组装了检测CSFV抗体的PPA-ELISA诊断试剂盒。该试剂盒与其他7种常见猪病毒（PRRSV、PPV、JEV、PCV-2、PEDV、PRV、TGEV）及牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的阳性血清不发生交叉反应;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与间接血凝试验相比较,符合率、敏感性和特异性分别为86.2%,85.4%,87.2%;与IDEXX ELISA试剂盒相比较,符合率、敏感性和特异性分别为91.3%,93.2%,88.7%。表明本试验研制的E2-PPA-ELISA抗体检测试剂盒具有良好的重复性、敏感性和特异性,将为CSFV的快速诊断、免疫猪群抗体水平监测和CSFV流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪外周血单个核细胞cDNA酵母表达文库的构建及与猪瘟病毒E2蛋白相互作用细胞蛋白的筛选

为研究猪瘟病-毒(CSFV)蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用,本研究通过SMART技术合成猪外周血单个核细胞(PBMC)双链cDNA,以携带与载体pGADT7-Rec重组位点同源序列的特异引物经long-distance PCR扩增双链cDNA.纯化双链cDNA并与载体pGADT7-Rec共转化酵母菌株Y187,经同源重组构建PBMC cDNA酵母表达文库.以CSFV E2蛋白为诱饵进行酵母双杂交筛选,得到阳性克隆根据序列比对分析结果,进一步进行共转化验证.结果显示筛选到17个与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,基因注释(GO)分析表明这些蛋白分别参与免疫、代谢、细胞生长与增殖、生物调节等过程,为研究它们与CSFV E2的相互作用奠定了基础.