不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌发育及二倍体形成的影响

卵母细胞的孤雌激活是研究哺乳动物受精机制和发育机理的有效方法,也是细胞核移植、显微注射受精技术、孤雌胚胎干细胞等研究内容中的重要环节。本试验分别用乙醇、SrCl2、钙离子载体A23187对小鼠卵母细胞进行单独孤雌激活,并分别与6-DMAP联合运用,对小鼠卵母细胞进行联合孤雌激活。结果显示：（1）不同激活剂单独或联合激活,对卵母细胞的激活率有显著影响（P〈0.05）,SrCl2组的激活率最高（92%～94%）;（2）相同激活剂对卵母细胞孤雌囊胚的发育率在单独激活组（SrCl2组,18%）和联合激活组（SrCl2＋6-DMA组,53%）中存在显著差异（P〈0.05）;（3）相同激活剂对卵母细胞二倍体率在单独激活组（钙离子载体A23187组,21%）和联合激活组（钙离子载体A23187＋6-DMA组,77%）中均存在显著差异（P〈0.05）。结果表明：（1）SrCl2可以对小鼠卵母细胞进行有效的孤雌激活;（2）联合激活法可以显著提高孤雌卵母细胞的囊胚发育率;3、6-DMAP可以抑制第二极体排出,显著提高孤雌激活卵母细胞的二倍体率。     

影响山羊胞质内单精子注射(ICSI)效果的因素研究

从鲜精与冻精、激活方法以及气相条件3个方面,开展影响山羊卵母细胞质内单精子注射（ICSI）效果的因素研究。结果发现：冻精受精率显著高于鲜精（52.21%VS 26.44%,P〈0.05）;与离子霉素5 min＋6-DMAP 3 h联合激活相比,离子霉素单独处理15 min能相对安全、简捷地激活ICSI后的山羊卵母细胞;低氧（5%O2）气相条件下的囊胚率（19.59%）显著高于高氧（20%O2）气相条件下（7.81%）的囊胚率（P〈0.05）。     

不同激活方法对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

通过系统探讨不同孤雌激活方法对猪卵母细胞体外激活后发育效果的影响,比较了乙醇（Ethanol,EH）、离子霉素（Ionomycin,Ion：5μmol/L）、氯化锶（Strontium chloride hexahydrate,Sr^2＋：10 mmol/L）、6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine,6-DMAP：2 mmol/L）和放线菌酮（cycloheximide,CHX：10 mg/L）对猪卵母细胞激活发育的效果。结果表明：（1）9%EH激活处理10 min效果好于15 min;（2）使用9%EH激活处理10 min,再结合CHX、6-DMAP、Sr^2＋、CHX＋Sr^2＋、Sr^2＋＋6-DMAP、CHX＋6-DMAP或CHX＋6-DMAP＋Sr^2＋组处理3～4 h,以EH＋6-DMAP组效果最好,分裂率及囊胚率分别达到82.86%和22.86%;（3）在使用化学激活（Ion＋6-DMAP组和9%乙醇10 min＋6-DMAP组）和电激活（50 V/mm,50μs,2t）的方法中,Ion法激活猪卵母细胞效果较好,囊胚率达到37.50%;（4）卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数4～6层和多于6层的卵丘-卵母细胞复合体孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为（68.99%,32.56%）和（75.36%,37.68%）,2组之间差异不显著（P〉0.05）;但其显著高于其他组（P〈0.05）,这2组细胞在猪孤雌激活发育研究中是最佳的实验研究材料。     

兔·卵·母·细·胞·孤·雌·激·活·的·研·究

本研究探讨了兔卵母细胞孤雌激活的方法。兔卵母细胞经7%乙醇单独激活处理5min的卵裂率(13.0%),显著低于乙醇处理后在2mmol/LDMAP继续处理3h(48.1%)和5μmol/L离子霉素处理后在DMAP继续处理3h的卵母细胞(92.2%);离子霉素+DMAP处理组的囊胚发育率(27.1%)亦显著(P<0.05)高于乙醇+DMAP处理组(15.4%)和乙醇单独处理组(0%)。当用离子霉素和DMAP激活处理时,注射hCG后18h卵母细胞的卵裂率(92.1%)和囊胚率(35.3%)最高2,4h后卵母细胞的卵裂率(19.0%)和囊胚发育率(4.2%)均显著(P<0.05)下降。卵母细胞经离子霉素激活处理后,在DMAP继续处理1、35、h的卵裂率差异显著(P<0.05);而囊胚发育率无显著(P>0.05)差异。离子霉素和DMAP处理后再电激1次对卵母细胞的卵裂率(83.3%、80.0%)和囊胚率(30.0%、27.0%)无显著(P>0.05)影响。以上研究表明:离子霉素+DMAP是兔卵母细胞最有效的激活方法,注射hCG后18h的卵母细胞可取得较好的激活效果。     

牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究

本试验主要比较了离子霉素、电脉冲两种方法激活牛、羊体外成熟卵母细胞的效率。两种激活方法中。牛胚胎卵裂率无显著差异（90．61％对94．40％，P〉0．05），而离子霉素激活胚胎的囊胚发育率极显著高于电激活方法（12．3％对2．4％，P〈0．01）。两种方法对羊胚胎的研究中，羊胚胎卵裂率无显著差异（72．4％对77．4％，P〉0．05）。但是离子霉素激活胚胎的囊胚发育率显著高于电激活方法（3．67％对10．40％，P〈0．05）。本试验中还比较了用化学激活法（离子霉素）激活牛体外成熟卵母细胞后，用SOFaa体系培养，换液与不换液对孤雌激活胚胎体外发育的影响。结果表明：在第4天不换液的胚胎卵裂率和囊胚率极显著高于换液的胚胎（11．64％对3．49％。P〈0．01）。     

不同激活条件及半胱氨酸处理对猪ICSI胚胎发育影响研究

本试验探讨了不同辅助激活方法(Calciumionophore A23187激活、Calciumionophore A23187+6-DMAP联合激活和电激活)、不同精子预处理方法(液氮冻融处理和0.1%Triton X-100处理)和在添加半胱氨酸的胚胎培养液中培养不同时间(0 h、4 h、12 h和168 h)对猪卵母细胞内单精子注射(ICSI)胚胎体外发育的影响。结果显示:与无辅助激活相比,A23187+6-DMAP联合激活和电激活均能显著提高ICSI卵母细胞的激活率、卵裂率和囊胚率(P0.05),A23187+6-DMAP联合激活能显著提高ICSI卵母细胞的受精率(P0.05)。液氮冻融精子组ICSI卵母细胞的雄原核形成率显著高于活精子组(P0.05)。在添加半胱氨酸的胚胎培养液中培养4 h的ICSI卵母细胞受精率、雄原核形成率和囊胚率显著高于0 h组(P0.05)。以上结果表明,猪卵母细胞在ICSI后需要辅助激活来启动胚胎顺利发育,A23187+6-DMAP激活效果较好。液氮冻融精子可以促进ICSI后雄原核的形成。半胱氨酸处理4 h对猪ICSI卵母细胞受精和发育均有促进作用。     

马卵母细胞胞质内精子注射后体外发育能力的研究

本研究在非繁殖季节评估卵丘形态(松散型、致密型)、成熟培养体系(TCM 199、NCSU 23)、体外成熟时间(34、38 h)和离子霉素结合6-DMAP激活对马卵母细胞胞质内精子注射(ICSI)后体外发育能力的影响。从屠宰场采集马卵巢,获得的卵母细胞进行体外成熟,然后注射马冷冻解冻精液,统计分裂情况。试验结果表明,①马松散型卵母细胞成熟率显著高于致密型卵母细胞(P<0.05),分别为61.09%和41.24%,但ICSI后36 h分裂率无显著差异(P>0.05),分别为47.34%和44.92%;②两种培养体系对马松散型或致密型卵母细胞成熟率及ICSI后36 h分裂率无显著影响(P>0.05),但相同成熟体系培养松散型卵母细胞成熟率均显著高于致密型卵母细胞(P<0.05),然而ICSI后36 h分裂率差异不显著(P>0.05);③松散型或致密型卵母细胞在TCM 199或NCSU 23中成熟38 h成熟率均高于34 h成熟率,分别为44.43%～68.87%和34.52%～58.90%,松散型卵母细胞在TCM 199体系中成熟34 h、ICSI后激活组或对照组的分裂率显著高于成熟38 h、ICSI后激活组的分裂率(P<0.05),以及致密型卵母细胞在TCM 199体系中成熟34 h、ICSI后激活组的分裂率(P<0.05),而且显著高于松散型卵母细胞在NCSU 23体系中成熟38 h、ICSI后对照组的分裂率(P<0.05);④ICSI后用离子霉素结合6-DMAP激活对马卵母细胞ICSI后36 h分裂无显著影响(P>0.05)。因此,马松散型和致密型卵母细胞的成熟能力存在差异,TCM 199和NCSU 23成熟体系对这2种类型卵母细胞的发育能力无显著影响(P>0.05),马卵母细胞成熟38 h成熟率高于34 h成熟率,TCM 199成熟体系培养松散型卵母细胞34 h进行ICSI后的分裂率最高。离子霉素结合6-DMAP激活对TCM 199或NCSU 23体系成熟马卵母细胞ICSI后的体外发育能力无显著影响(P>0.05)。     

曲古抑菌素(Trichostatin)A对猪卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响

曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）是一种组蛋白去乙酰化抑制剂,用TSA处理鼠核移植胚胎可显著提高胚胎的囊胚率。检验TSA对猪卵母细胞体外成熟以及孤雌胚胎发育的影响。在猪卵母细胞体外成熟液及胚胎培养液中添加TSA,比较不同浓度TSA对卵母细胞成熟的影响,不同浓度TSA对孤雌胚胎发育能力的影响以及TSA处理不同时间对孤雌胚胎发育能力的影响。结果发现：（1）5nmol／LTSA处理对卵母细胞体外核成熟无显著影响,却显著提高了卵母细胞孤雌胚胎的卵裂率和囊胚率（P〈0．05）;（2）50nmol／LTSA处理显著提高了孤雌胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05）;（3）50nmol／LTSA处理24h能显著提高胚胎的卵裂率及囊胚率（P〈0．05,82．1％&#177;2．6％和37．4％&#177;3．1％）。结果表明TSA对猪卵母细胞的体外成熟及孤雌胚胎发育具有显著的促进作用。5nmol／L的添加量对卵母细胞的体外胞质成熟具有促进作用;胚胎培养基中添加50nmol／LTSA处理24h能提高孤雌胚胎的发育能力。     

细胞骨架抑制剂、电激活液对兔卵孤雌激活和发育的影响

应用细胞骨架抑制剂细胞松弛素B和秋水仙素处理兔成熟卵母细胞，然后采用电激活的方法激活兔卵母细胞，观察细胞骨架抑制剂对兔卵母细胞孤雌激活和孤雌发育的影响，结果表明：应用不同的电激活液，即甘露醇、Zimmerman氏和山梨醇对兔卵母细胞的孤雌激活效果无显著性差异（P〉0．05）；用7．5μg&#183;mL^-1细胞松弛素B处理卵母细胞后孤雌激活，其2-细胞胚率（82．2％）和囊胚发育率（43．4％）与对照组（76．4％和51．5％）相比无显著性差异（P〉0．05）；用1μg&#183;mL^-1秋水仙素处理兔卵母细胞，兔卵母细胞孤雌激活后的2-细胞胚率（64．9％）和囊胚发育率（23．8％）明显下降，与对照组相比存在显著性差异（P〈0．05）；用细胞松弛素B和秋水仙素共同处理的2-细胞胚率（62．5％）和囊胚发育率（30．9％）与秋水仙素单独处理的结果无显著性差异（P〉0．05）。因此，秋水仙素对兔卵母细胞的孤雌激活影响比CB更大。通过免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜观察发现，细胞骨架抑制剂处理后，经孤雌激活获得的囊胚中，微丝和微管结构未见异常。     

3种中药单体成分对猪孤雌激活胚胎体外发育效果的影响

为了建立良好的猪胚胎体外培养体系,以体外成熟培养的卵母细胞为材料,研究中药单体成分川芎嗪（Lig）、小檗碱（BR）和淫羊藿苷（Ica）对猪孤雌激活胚胎体外培养效果的影响。以NCSU-23基础培养液为对照组,采用同一种孤雌激活方案,在培养液NCSU-23中分别添加中药单体成分川芎嗪、小檗碱和淫羊藿苷的小、中、大剂量（Lig1、Lig2、Lig3;BR1、 BR2、BR3;Ica1、Ica2、Ica3）为3个试验组,比较了各组猪孤雌激活早期胚胎的发育效果,从而进行中药单体成分最佳浓度的筛选。结果显示：①孤雌激活胚胎体外发育至48 h的卵裂率和第7天的囊胚发育率, Lig1组与对照组和Lig2组之间差异显著（P< 0.05）,与Lig3组差异极显著（P<0.01）。②BR2组的卵裂率与对照组和BR3组之间差异显著（P<0.05）,与BR1组无显著差异（P>0.05）。第7天囊胚发育率BR2组显著高于其他各组（P<0.05）,其他各组之间无显著差异（P>0.05）。③Ica2组胚胎发育至48 h的卵裂率和第7天的囊胚发育率均显著高于其他各组（P<0.05）,而其他各组之间无显著差异（P>0.05）。由此可见,在NCSU-23基础液中添加3种中药单体成分最佳浓度均能显著提高猪孤雌胚体外发育效果。     

不同浓度离子霉素对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

试验探讨了不同浓度的离子霉素结合6-二甲氨基嘌呤激活猪体外成熟卵母细胞后对其孤雌发育的影响。体外成熟卵母细胞分别用10、15、20、25mol/L的离子霉素处理40min,再用2mmol/L的6-DMAP处理8h,各组的卵裂率分别是:(13.11±6.75)%,(22.31±14.18)%,(26.93±24.53)%和(26.72±19.75)%,囊胚率分别是2.26±1.03)%,(2.39±2.41)%,(3.32±3.95)%和(11.76±10.76)%,各组之间差异不显著(P>0.05)。结果表明:用10～25mol/L离子霉素和6-DMAP联合激活猪体外成熟卵母细胞,对其孤雌发育能力有一定影响,但效果不显著;猪卵母细胞采用离子霉素激活的最佳方案是用25mol/L处理40min,再用浓度为2mmol/L的6-DMAP处理8h。     

无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟方法的初步探讨

主要探讨无卵丘水牛卵母细胞体外成熟的可行性,以便为研究卵母细胞成熟机理提供模型。无卵丘的水牛卵母细胞随机分为5组,然后分别进行直接成熟培养（M1）,与卵丘细胞单层共培养（M2）,用未扩展的卵丘细胞块包围培养（M3）,与扩展的卵丘细胞团共培养（M4）和用卵巢组织包围培养（M5）。无卵丘的水牛卵母细胞体外成熟培养24 h后检查第一极体（PB1）排出率,随后对这些卵母细胞进行孤雌激活,评定其成熟质量。结果发现,M4组的第一极体排出率明显高于M1组和M5组,其它各组间没有显著差异（P〉0.05）;M5组的孤雌激活卵裂率显著低于M1组和M4组（P〈0.05）,而与M2组和M3组没有显著差异（P〉0.05）,但M3和M4两组的囊胚发育率显著高于M1组和M5组（P〈0.05）。这些研究结果表明：（1）未扩展卵丘细胞包围法和扩展卵丘细胞团支撑法可促进无卵丘水牛卵母细胞的体外成熟,但与卵丘细胞单层共培养没有作用;（2）卵巢组织包围培养不利于水牛卵母细胞的体外成熟。     

黄淮白山羊孤雌胚胎的体外培养

采用离子霉素和6-DMAP对黄淮白山羊体外成熟卵母细胞进行联合激活,分别在不同的培养体系进行体外培养,观察孤雌胚胎的发育情况。培养体系分别为:无共培养条件下,M199(10?S)、CR1aa和HTF P1;颗粒细胞共培养条件下,CR1aa、HTF P1和SOFaa。结果发现,无共培养条件下,CR1aa和HTF P1组孤雌胚胎的卵裂率显著高于M199组(P<0.05),但3组均未有囊胚;共培养条件下,HTF P1组的卵裂率显著高于CR1aa和SOFaa组(P<0.05),而CR1aa组的囊胚率却显著高于其他2组(P<0.05)。综合试验结果说明,CR1aa联合颗粒细胞共培养能够获得较好的培养效果,适用于山羊孤雌胚胎的体外培养。     

猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活参数研究

本研究比较了按不同方法贮藏的培养液对猪卵母细胞体外成熟及成熟后孤雌激活对胚胎发育的影响。此外,还探索了针对初情期前母猪体外成熟卵母细胞和孤雌激活方案。结果如下：①1.4 kv/cm、100 μs、1DC电激活后,卵母细胞死亡率明显高于2.0 kv/cm、30 μs、1DC和2.0 kv/cm、60 μs、1DC处理组,但激活后胚胎卵裂率和囊胚率相似;②使用钙离子载体和6-二甲基氨基嘌呤（Ionomycin+6-DMAP）处理后,胚胎卵裂及囊胚率都明显不如电激活处理;③6次独立试验结果证明：经4℃冷藏和-20℃冷冻保存的培养液用于猪卵母细胞培养,其体外成熟率、孤雌激活后的卵裂率及囊胚发育率无显著差异（P＞0.05）。说明成熟卵在2.0 kv/cm、30 μs、1DC或者 2.0 kv/cm、60 μs、1DC电击参数激活下可以降低死卵率;按本试验设计的电激活方案处理初情期前母猪成熟卵优于化学激活;在-20℃冷冻保存猪卵母细胞成熟液是可行的。      

玻璃化冷冻对猪MⅡ卵母细胞皮质颗粒分布及其激活后胚胎发育能力的影响

本实验旨在探讨玻璃化冷冻保存对猪MⅡ期卵母细胞皮质颗粒分布和孤雌激活后早期胚胎发育能力的影响。实验将卵母细胞随机分为对照组、毒性实验组和冷冻组。采用EFS40和EDFS40两种玻璃化冷冻液处理,卵母细胞经恢复后对其进行染色,观察皮质颗粒的分布;并对另一部分卵母细胞实施孤雌激活,观察早期胚胎的发育。结果表明:毒性实验组和冷冻组卵母细胞皮质颗粒部分释放、完全释放的比例无显著差异,但均显著高于对照组(P<0.05)。不同毒性处理组和不同冷冻组间对皮质颗粒的分布无显著差异。与毒性实验组相比,冷冻处理组显著降低皮质颗粒在皮质区分布的比例(P<0.05)。EFS40毒性实验组孤雌激活后的存活率、卵裂率、囊胚发育率均显著高于EDFS40毒性实验组(86.6%vs.75.0%)、(61.8%vs.40.7%)、(30.2%vs.23.5%)(P<0.05)。EFS40冷冻组存活率显著高于EDFS40冷冻组,但均显著低于对照组。结果显示,抗冻保护剂处理和玻璃化冷冻均导致猪卵母细胞皮质颗粒释放,与EDFS40相比采用EFS40较适合猪MⅡ期卵母细胞冷冻保存。     

激活方法对水牛卵母细胞孤雌发育的影响

系统探讨了几种激活方法对水牛卵母细胞孤雌发育的影响。体外成熟 (IVM) 2 6 h的水牛卵母细胞经 7%乙醇(EH)、钙离子载体 (A2 3187)或离子霉素 (Ion)激活处理 5 min后 ,在 2 m mol/ L 6 -甲二氨基嘌呤 (6 - DMAP)中培养 3～4 h,然后再继续培养 6～ 11d,观察其胚胎发育情况。结果发现 ,5μmol/ L Ion激活处理的水牛卵母细胞分裂率显著高于 EH处理的卵母细胞 (6 3.0 % vs5 4 .2 % ,P<0 .0 5 ) ,其原核形成率也显著高于 EH处理的卵母细胞。激活处理前 ,无Ca2 培养液孵育时间的长短 ,对水牛卵母细胞孤雌发育无显著影响 (P>0 .0 5 )。如用 A2 3187激活处理水牛卵母细胞 ,其激活分裂率则随着浓度的升高而提高。从而表明 ,5 μmol/ L Ion可有效激活水牛卵母细胞     

不同化学激活方法对猪卵母细胞孤雌激活效率的影响

为了选择最佳化学激活方法提高猪卵母细胞孤雌激活的卵裂率及囊胚率,试验采用不同浓度离子霉素(ionomycin)及其分别与6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAp)、细胞松弛素(CB)、放线菌酮(CHX)及9%乙醇作用不同时间对猪卵母细胞进行孤雌激活。结果表明:20μmol/L离子霉素作用10min和20min,卵裂率和囊胚率较高;离子霉素分别与6-二甲基氨基嘌呤、细胞松弛素组合卵裂率和囊胚率较高,但两者差异不显著;离子霉素与9%乙醇作用10min和20min卵裂率和囊胚率也较高,两者之间差异不显著。     

人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响

为了探讨人颗粒细胞共培养对牛卵母细胞体外成熟及孤雌激活的影响,将穿刺获得的牛卵母细胞随机分为试验组和对照组,试验组以人颗粒细胞作为滋养层与牛卵母细胞在体外成熟液中共培养,对照组仅使用与试验组相同的体外成熟液培养,观察并比较两组的极体排出率、孤雌激活囊胚形成率。结果发现,试验组的极体排出率（72.35％）显著高于对照组的极体排出率（52.86％）（P＜0.01）;经过孤雌激活后,试验组的囊胚形成率为12.82％,对照组为4.76％,两组之间无显著性差异（P＞0.05）。说明人颗粒细胞可以作为牛卵母细胞体外成熟时的滋养层,两者共培养可以提高牛卵母细胞体外培养的核成熟率。     

虾青素对猪卵母细胞体外成熟的影响

本研究旨在探讨虾青素(astaxanthin, Ast)对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活胚胎发育的影响,为进一步优化猪卵母细胞体外成熟培养体系提供参考。首先,将GV期猪卵母细胞培养在添加有不同浓度虾青素(0,5,10,20,40μmol/L)的体外成熟液中,40～44 h后统计第一极体排出率。结果显示与对照组相比,各处理组卵母细胞的第一极体排出率均显著升高(P<0.05),其中10μmol/L处理组卵母细胞的第一极体排出率显著高于5,20,40μmol/L处理组(P<0.05)。随后对MⅡ期卵母细胞进行孤雌激活处理,结果发现10μmol/L和20μmol/L处理组的卵裂率和囊胚发育率显著高于对照组(P<0.05),且10μmol/L处理组囊胚发育率显著高于20μmol/L处理组(P<0.05)。最后,检测虾青素处理后MⅡ期卵母细胞的活性氧水平、丙二醛及谷胱甘肽的含量,以及整个胚胎发育阶段中抗氧化酶相关基因SOD1和GPX4的表达变化,发现GV期卵母细胞经10μmol/L虾青素处理后,孤雌激活囊胚的细胞数极显著升高(P<0.01);而MⅡ期卵母细胞的活性氧水平...     

山羊卵母细胞体外培养体系及冻存后体外培养的研究

随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究和商业化胚胎移植技术的快速发展,对卵母细胞的需求量急剧增加。而冷冻的卵母细胞可为胚胎工程技术研究提供方便、丰富的材料来源。试验以屠宰场云岭黑山羊卵巢卵母细胞为实验材料,研究冷冻后的山羊卵母细胞体外培养体系。结果表明,采用传统成熟培养液（OM＋10%FBS）与在其中添加1%ITS（OM＋10%FBS＋1%ITS）对卵母细胞培养成熟率无显著差异（71.6%vs 76.2%）,而孤雌激活的卵裂率差异显著（60.5%vs 71.5%）。用优化的卵母细胞成熟体系培养解冻后的GV期COCs,成熟率31.5%;用添加有ITS和EGF的胚胎培养液培养解冻后GV和MII期孤雌激活的卵母细胞,其卵裂率分别为35.6%、58.4%,差异极显著（P〈0.01）。