PRRSV经典与高致病性毒株RT-PCR鉴别检测方法的建立

根据GenBank登录的经典与高致病性PRRSVNsp2序列,设计了1对引物,所扩增的序列包含高致病性毒株缺失部分,用于区分经典与高致病性毒株,并对扩增条件进行了优化。结果表明,应用该方法,能从经典与高致病性PRRSV基因组中分别扩增出573,483bp的特异性片段,病毒基因组混合后能够同时扩增;并可以检测出1.8TCID50/100μL经典毒株及0.6TCID50/100μL高致病毒株的病毒RNA;对CSFV,JPV,PEDV,TGEV,RV,PPV,PRV,PCV-2等常见猪病毒病病原的鉴别诊断均为阴性;对分离的8株PRRSV进行检测,3株为经典毒株,5株为高致病毒株;对采集的59份确诊病料进行了检测,21份为经典毒株感染,38份为高致病毒株感染。本研究建立的RT-PCR诊断方法,具有特异、灵敏、快速等特点,可用于区分PRRSV经典与高致病毒株。     

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。     

PRRSV高致病性毒株RT-PCR鉴别诊断方法的建立

根据GenBank中已发表的PRRSV的NSP2基因序列,设计一对特异性引物。针对经典型毒株与高致病性毒株,采用RT-PCR方法扩增,可分别扩增出相应的576bp,486bp的目的片段。从而在检测PRRSV的基础上,进一步区分PRRSV的经典型和高致病性毒株。通过对扩增条件的筛选,成功地建立了猪繁殖与呼吸综合征经典型与高致病性毒株的RT-PCR鉴别诊断方法,且为PRRSV分离株的鉴定分型及NSP2功能研究奠定了基础。     

北美型猪蓝耳病病毒鉴别RT-PCR检测方法的建立及应用

参考Genbank发表的美洲型猪蓝耳病病毒(porcine reproductive and respiratory syndrone virus,PRRSV)CH-1a(北美型经典PRRSV)、JXA1(北美型HP-PRRSV)等毒株的的主要结构蛋白基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对特异性的北美型PRRSV鉴别检测引物,其对经典PRRSV的扩增片段为511bp,对HP-PRRSV的扩增目片段为421bp。进行了该方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了美洲型PRRSV鉴别RT-PCR检测方法。应用此法对2010年1—12月收集的126份临床样品进行了检测,总体检出率达53.17﹪。结果表明该方法具有特异、敏感、重复性好等优点,可用于北美型PRRSV的临床发病鉴别检测及流行病学监测等工作。     

高致病性PRRSV SC-JX01株Nsp2基因的序列分析和抗原表位预测

将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNAStar软件进行序列分析。结果表明,SC-JX01株Nsp2基因与GenBank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性为98.1%~99.1%,氨基酸的相似性为95.9%~98.0%,具有相同的30个氨基酸缺失。本研究表明,SC-JX01株Nsp2基因与分离自不同地区高热病毒株的Nsp2基因序列具有相同的缺失。由于SC-JX01株的Nsp2基因存在氨基酸的缺失,与VR2332株比较,其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。     

2004-2009年河北省规模猪场猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异分析

为了解河北省规模猪场PRRSV的变异情况,采用RT-PCR方法对2004-2009年采集的16个典型发病场的病料样本进行PRRSV Nsp2基因扩增、克隆和测序,利用DNA star软件分析所测序列。结果表明,从样本中扩增的16个Nsp2基因中,有8份均在第481位和533～561缺失30个氨基酸,有8份没有缺失。表明,危害河北省规模猪场的PRRSV已经发生了较大的变异,其中2004-2005年的属低致病性PRRSV毒株,2006-2007年的属高致病性PRRSV毒株,而2008-2009年这两种毒株在规模猪场中均存在。     

PRRSV LN／0901株的分离鉴定及其NSP2基因遗传变异分析

采集可疑为猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）阳性的猪肺脏病料,通过Marc-145细胞培养、电镜观察、中和试验、RT—PCR检测等方法鉴定,确认从辽宁省分离到1株PRRSV,暂命名为PRRSVLN／0901株。进一步经Nsp2基因克隆测序及同源性比较及系统发育进化树等分析,结果证明该毒株属北美洲型,与2006年以来国内的多数流行变异株遗传关系相近且独立分支,说明导致辽宁地区流行的猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）病原属于北美洲型PRRSV,而且存在不断变异的趋势。     

应用灭光定量RT-PCR方法检测PRRSV变异株在仔猪体内动态分布

为进一步了解高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异株(HuN4株)在体内的动态分布规律和特点,探讨病毒对组织器官的嗜性,本研究将HuN4株和细胞传代致弱毒株HuN4-F65人工感染40日龄健康仔猪,分别于感染后1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d各迫杀2头,并应用建立的荧光定量RT-PCR方法对脑、颌下淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和十二指肠等组织及血清中的PRRSV进行定量检测.结果显示:感染后HuN4组各器官病毒载量比HuN4-F65组高100倍,病毒栽量峰值期出现在感染后7 d,随后呈下降趋势.HuN4株在仔猪体内分布广泛,在21 d的试验期内持续存在,并且各器官的病毒载量呈正态分布规律;而HuN4-F65株血清病毒载量较低,并且集中在单核巨噬细胞相对密集的扁桃体和颌下淋巴结,与HuN4株主要嗜性器官肺脏相比发生了改变.     

检测CSFV、PRRSV和JEV感染的多重RT-PCR方法的建立及初步应用

为了建立1种能够应用于临床样本可以同时检测CSFV、PRRSV、JEV 3种RNA病毒感染的多重RT-PCR方法。根据GenBank收录的CSFV、PRRSV、JEV的基因组全序列,选择3种病毒的特异性保守区序列设计了3对特异性引物,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能够同时检测3种病毒混合感染的多重RT-PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法分别从CSFV、PRRSV、JEV毒株以及3种病毒的混合物中扩增出大小分别为777、451、605bp的3条特异性条带,其他对照组检测均为阴性;敏感性分析表明,该方法最低检测量分别为14.2、10.0、8.0pg的CSFV、PRRSV、JEV的RNA;初步应用性试验表明,52份疑似病料中PRRSV、CSFV和JEV的阳性率分别为46.1%、21.1%和1.92%;CSFV和PRRSV混合感染阳性率为21.1%。CSFV、PRRSV和JEV混合感染阳性率为3.84%。本试验建立的多重RT-PCR检测方法具有敏感性高、特异性强、重复性好的特点,可以有效检测CSFV、PRRSV和JEV的混合感染。     

PRRSV美洲型经典株、变异株和疫苗株多重RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

为建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的快速鉴别检测方法,本研究针对PRRSV美洲型经典株、高致病性变异株以及TJM-F92疫苗株的Nsp2基因序列特点,设计2对特异性引物。经优化反应条件后,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典株、变异株及疫苗株的多重RT-PCR方法。该方法特异性强,与猪其他病毒间不存在交叉反应;敏感性高,对重组质粒标准品的检出下限为1.13×10³拷贝/μL。应用所建立的方法对349份临床疑似病料进行检测,结果检出PRRSV阳性119份,其中美洲型经典株5份、变异株107份、TJM-F92疫苗株7份,且有变异株和TJM-F92疫苗株混合阳性7份。表明本研究成功建立了PRRSV美洲型经典株、变异株及TJM-F92疫苗株的多重RT-PCR鉴别检测方法,可用于PRRSV的临床检测及流行病学调查。     

欧洲型PRRSV RT-PCR检测方法的建立及ORF7基因序列比较

根据PRRSV(LV株)ORF7基因设计一对引物,建立了欧洲型PRRSV的RT-PCR检测方法.通过对50份组织病料检测及其ORF7基因序列分析,结果表明,有4份组织病料扩增出欧洲型PRRSV 576bp特异性片段,阳性率为8%,其ORF7基因序列和氨基酸推导序列与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株(AMERVAC-PRRS)的同源性分别在99.0%～99.7%和98.5%～100%之间,而与标准毒株(LV)的同源性分别在95.9%～96.6%和96.9%～97.7%之间.表明该PT-PCR体系适合组织病料中欧洲型PRRSV的直接检测,同时也证实了欧洲型PRRSV在我国的存在,并且与疫苗株之间具有较高的同源性.     

一步法RT-PCR同时检测CSFV和PRRSV方法的建立及应用

猪瘟(CSF)和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害云南养猪业的传染病,为了建立一种能快速诊断猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征混合感染的方法,根据NCBI上已发表的猪瘟病毒(CSFV)保守基因Erns和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守基因M基因的核苷酸序列,利用Oligo 6.0设计了2对特异性引物,经过PCR反应...     

2007年-2010年江苏省高致病性PRRSV分离株遗传特征分析

为了了解江苏省高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,本研究在2007年-2010年从江苏不同地区采集病料,利用RT-PCR方法进行病毒检测.结果发现江苏地区所有毒株都属于美洲型毒株,且Nsp2基因都存在不连续的30个氨基酸的缺失,缺失氨基酸的位置为481位和533位～561位.病毒分离株PRRSV...     

Nsp9基因实时荧光定量PCR检测方法的建立及其在感染细胞过程中表达量的变化

试验旨在建立猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因的实时荧光定量PCR检测方法,并探究其在感染细胞过程中表达量的变化。根据PPRSVNsp9基因序列设计引物,建立基于SYBR Green Ⅰ检测模式的实时荧光定量PCR。结果显示,PRRSV Nsp9基因在1×10⁴~1×10⁸拷贝/μL范围内有很好的线性关系,扩增产物的熔解曲线只有1个单特异峰,无引物二聚体。该方法与猪戊肝病毒（HEV）、猪流感病毒（SIV）、伪狂犬病病毒（PRV）基因组均无交叉反应,可重复性好,组内变异系数小,可用于临床PRRSV检测。在病毒感染细胞过程中,Nsp9基因表达量逐步升高,36 h达到最高。本研究为探究病毒复制规律与临床疫苗生产奠定了理论基础。     

Establishment of the Quantitative Real-time PCR Method for PRRSV Nsp9 Gene Rapid Detection and Its Expression in PRRSV Infected Cells

The study was conducted to establish a quantitative Real-time PCR method for PRRSV Nsp9 gene rapid detection and study its expression in PRRSV infected cells.A pair of specific primers targeted to Nsp9 of PRRSV was designed and a Real-time PCR method based on SYBR Green Ⅰ fluorescent was developed for the quantization of PRRSV.The melting curve analysis using SYBR Green Ⅰ dye showed one specific peak,and no primer dimers peak was observed.No amplification was detected from HEV,SIV and PRV samples by this method.There was good reproducibility and low variation coefficient.The quantitative Real-time PCR method developed in this study would be useful for rapid laboratory diagnosis and epidemiology investigation of PRRSV.During the process of virus infecting cells,the expression level of Nsp9 increased gradually,and it got the highest at 36 h.This study laid the theoretical basis to explore the law of virus replication and clinical vaccine production.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

参照国内外已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF7的基因序列及其相关的RT—PCR检测方法设计一对引物,扩增目的片段为535bp。通过对RT—PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性试验,建立了一种PRRSV的RT—PCR检测方法。该方法具有快速、敏感、特异等优点,可用于PRRSV的检测、流行病学调查等。应用此方法对临床样品进行了检测,阳性检出率达66．79／5。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法.结果显示,该方法在检测101 copies/μL～108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系.标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100％和107％;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5％,具有良好的重复性.利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM) 72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录 水平显著上调.本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法.