猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.     

牛病毒性腹泻病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank公布的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)全基因组序列,选择保守性比较高的5'非编码区,利用Oli-go6.0软件设计了2对特异性引物,建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法。结果表明,该方法重复性好、特异性强、敏感性高,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,极大地提高了常规RT-PCR检测方法的特异性和敏感性。临床初步应用表明,该方法可用于动物与疫苗生物制品原辅料BVDV的快速低含量检测。     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR诊断方法的建立

根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株的基因序列,分析合成了一对扩增跨幅为190bp左右的引物,对牛病毒性腹泻病基因I型或基因II型的毒株进行RT-PCR扩增,结果是取得了与预期大小一致的RT-PCR产物,而对照样品的扩增全为阴性;该方法最低可检测到0.10ng的牛病毒性腹泻病毒RNA。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒和牛病毒性腹泻病毒双重RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5'端非编码区基因序列,设计合成了1对特异性引物,参考本实验室针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白设计的引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV和PRRSV双重RT-PCR的检测方法。对于PRRSV和BVDV的cDNA最低检测量分别为3.8×10-4 ng和7×10-4 ng,对于猪瘟病毒(CFSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的PCR扩增结果均为阴性;用该方法对江苏省不同地区采集的75份仔猪的肺脏、脾脏和淋巴结等病料进行了检测,结果PRRSV有55份阳性,BVDV有14份阳性,PRRSV和BVDV混合感染的有12份,与PRRSV和BVDV单一RT-PCR的检测结果符合率分别为89.3%和92%。证明建立的双重RT-PCR检测方法可用于临床样品中BVDV和PRRSV的检测。     

猪源牛病毒性腹泻病毒的流行初探

根据牛病毒性腹泻病毒(BVDV)代表株NADL的NS5B基因序列,设计合成2对引物进行套式PCR,检测从浙江、安徽、湖南、江西、广西、辽宁等地采集的43份猪病料中BVDV的流行情况,结果有7份病料可以扩增出360bp的特异性条带,阳性率为16.3%。为追踪BVDV在猪体中的流行来源,我们又对细胞培养用国产及进口犊牛血清进行了检测,结果也能扩增到目的条带。对这些病料和血清中扩增出的目的条带进行克隆、测序,并用DNASTAR软件分析,结果表明这些目的片段均为BVDV序列,这些不同BVDV序列可以分为两个亚群,ZJ133、HN386、LN247、NCS-J属于BVDV-Ⅰa亚型,ZJ114、AH138、JX60、GX96、NCS-G、DZ属于BVDV-Ⅰb亚型。这些毒株与BVDVI型间的同源性为80.3%-98.6%,与BVDV-Ⅱ型的同源性为72.2%-74.4%。本文研究结果说明我国猪群中BVDV感染情况已经比较严重,应该予以重视。     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

猪感染牛病毒性腹泻病毒的诊断

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)除可感染牛外,还可以感染猪、绵羊、山羊、鹿及野生动物。猪感染BVDV后会出现类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化。本文通过对猪场发病猪进行临床及实验室诊断,最终确定由牛病毒性腹泻病毒感染所致,建议加强对该病的综合防控。     

牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、特异、灵敏的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)Taq Man实时荧光定量RT-PCR的方法,根据NCBI GenBank上已公布的BVDV、猪瘟病毒(CSFV)核酸序列进行比对,利用Oligo 6.71软件设计一对引物及一条探针,建立了检测BVDV的Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、重复性及其敏感性进行相关试验,结果表明该方法检测出BVDV标准毒株Oregon C_(24)V为阳性,猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和CSFV的检测均为阴性。对BVDV标准毒株最低检测量达到10~(-2.5) TCID_(50)。该方法检测同一样品重复进行8次检测,结果均一致,表明方法的重复性较好。应用该方法对6批猪瘟疫苗专用血清进行BVDV检测,阳性率为16.7%;猪瘟弱毒苗中未检出BVDV。建立的BVDV Taq Man实时荧光定量RT-PCR方法为生产无BVDV污染的猪瘟苗提供了有力的保障。     

牛病毒性腹泻病毒不同检测方法的比较研究

采用Idexx公司抗原捕获ELISA试剂盒对新疆部分地区160份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒抗原检测,结果有6份样品为阳性,对该6份血清用BVDV阴性血清进行了系列稀释后,分别用抗原捕获ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR进行检测,发现RT-PCR方法比ELISA检测灵敏度高10-100倍,荧光RT-PCR比RT-PCR灵敏度高约10-100倍。     

牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA检测方法的标准化研究

用纯化牛病毒性腹泻病毒免疫蛋鸡制备出的卵黄抗体作为包被抗体,采用自制的单抗为一抗,建立牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA方法。通过试验确定,抗牛病毒性腹泻病毒卵黄抗体最佳包被浓度为1:50;McAb最适稀释浓度为1:10,HRP-羊抗鼠IgG工作浓度为1:800。通过引入牛病毒性腹泻病毒质控血清进行质控检验,该方法所得检测结果均在质量控制范围内,达到预定标准化要求。标准化的抗原捕获ELISA方法具有特异、灵敏、可靠、方便、快捷等特点,可广泛应用推广,为我国牛病毒性腹泻病毒监测提供了行之有效的技术手段。     

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原捕获ELISA检测方法的建立

用牛病毒性腹泻病毒(BVDV)单克隆抗体包被酶标板,以兔多克隆抗体作为夹心抗体,建立BVDV抗原捕获ELISA(AC-ELISA)检测方法,优化反应条件并对该方法的稳定性等指标进行了测试和评价。结果表明,单抗最佳包被质量浓度为5μg/mL,兔多抗血清最佳质量浓度为10μg/mL;单抗在4℃包被12~24 h,多抗在37℃作用1 h为双抗体的最佳反应条件;酶标抗体最适稀释度1∶10000,最适作用时间为1 h;采用1%BSA和1%明胶分别在抗体包被后和加入待检抗原反应后进行两次封闭效果好。用AC-ELISA方法检测临床采集的11份牛腹泻病料和12份健康牛组织样品,同时以病毒分离和RT-PCR检测方法做对比,3种方法符合率很高。研究表明AC-ELISA方法稳定性好,可用于BVDV的临床快速检测。     

牛病毒性腹泻的鉴定以及治疗

为了鉴定甘肃武威地区某牛场中牛病毒性腹泻病的发病情况,分别采集了13只病牛的血液样品、粪便样品配合诊断,通过血清学诊断方法和PCR鉴定的方法对样本进行了检测,结果显示血清学方法中的13份血液样本有8份为阳性,粪便样本提取RNA,进行RT-PCR同样可以检测到8份样本中扩增得到片段大小为267bp的条带,检测的13份样本有8份样本的血清学检测和粪便PCR检测均为阳性,本次检测的阳性率为61.54%,结果表明本次检测的甘肃武威地区某养殖场的牛病毒性腹泻阳性率相对较高,需要加强牛病毒性腹泻的防控,采取科学的手段治理该类疾病降低其对养牛产业的损失。     

牛病毒性腹泻的诊断与治疗

为保障牛群的健康成长,应格外重视牛常见病毒性腹泻的诊治工作。对此,掌握牛病毒性腹泻的发病机理与临床症状表现,可更加精准地诊断出牛病毒性腹泻疾病,并做好相应的治疗;同时,牛群养殖人员与当地动物防疫部门应共同协作,从防治角度尽可能地降低牛病毒性腹泻发病率,保障牛群健康成长的同时也保障当地畜牧业的可持续发展。     

Development of a novel diagnostic test for detection of bovine viral diarrhea persistently infected animals using hair

The purpose of this study was to determine whether manually plucked hairs might serve as an alternative sample for a quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) testing. Twenty three, 1~3 week old, non-bovine viral diarrhea virus (BVDV) vaccinated calves, found to be positive for BVDV by immunohistochemical staining, were selected and hairs were manually plucked from the ear. qRT-PCR was performed on samples consisting of more than 30 hairs (30~100) and whole blood. All 23 animals were positive for the virus by qRT-PCR performed on the whole blood and when samples of more than 30 hairs were assayed. Additionally, qRT-PCR was performed on groups of 10 and 20 hairs harvested from 7 out of 23 immunohistochemical staining-positive calves. When groups of 20 and 10 hairs were tested, 6 and 4 animals, respectively, were positive for the virus.     

应用套式RT—PCR检测猪瘟制品中牛病毒性腹泻病毒污染的研究

为建立猪瘟制品中牛病毒性腹泻病毒（BVDV）污染的诊断方法,本研究根据GenBank公布的BVDV全基因组序列,选择BVDV保守性比较高的5′非编码区,利用Olig06．0软件设计了2对特异性引物,建立了检测BVDV的套式RT-PCR方法。该方法极大提高了常规RT-PCR检测方法的特异性和敏感性,重复性好、特异性强、敏感性高,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,为动物与疫苗生物制品原辅料中BVDV的快速低含量检测提供了一种简单、特异、敏感、快速的检测方法。     

牛病毒性腹泻病毒CC13B株全基因组序列及分析

从长春地区某牛场发生疑似为牛病毒性腹泻-黏膜病的病牛粪样中分离到1株病毒,经序列测定为牛病毒性腹泻病毒命名为BVDV CC13B株。核苷酸序列的测定结果显示,CC13B毒株的完全基因组序列由12 265个核苷酸组成,其中5′端非编码区包含380个核苷酸,3′端非编码区包含188个核苷酸。病毒基因组含有1个大的读码框架,编码1个由3 898个氨基酸组成的前体多聚蛋白。序列对比结果显示,CC13B毒株的核苷酸和氨基酸序列与国外CP-5A毒株同源性最高,分别为为96.2%和97.3%;而与国内分离株JZ05-1的同源性最低,分别为69.8%和71.0%。系统进化树分析结果表明,CC13B毒株与国内分离的长春184、Xinjiang-3156和H等分离株归类为BVDV基因Ⅰ型的Ib基因亚型。结果表明,长春地区近年发生的牛病毒性腹泻-黏膜病依然主要由BVDV基因Ⅰ型毒株引起。     

青海省牛传染性鼻气管炎及病毒性腹泻黏膜病血清学调查

从青海省互助、玛多、海晏、玉树、贵德、德令哈、共和等14个地区采集牛血清样品420份,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）调查了青海省牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻黏膜病的感染情况。结果在被检牛血清420份样品中,共检出阳性血清样品228份,平均阳性率为50.67%（228/420）;在被检牦牛血清180份样品中,共检出阳性血清样品1份,平均阳性率0.56%（1/180）。