胸膜肺炎放线杆菌的PCR诊断方法研究

采用胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,App)外膜脂蛋白Om/A基因序列合成了1对特异性引物,建立了用于检测App的PCR方法.结果表明:经过PCR扩增,3株App分离株均能扩增出长约950 bp的预期DNA片段,而大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella sp.)、支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、葡萄球菌(Staphylococcus sp.)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、变形杆菌(Proteus sp.)和链球菌(Streptococcus sp.)等与猪病有关的8种病原菌均为阴性;App DNA最低检出浓度可达55.0 ng/mL,且试验结果与传统的生化反应鉴定结果完全一致,符合率达100%,证明此方法特异性和敏感性强,可用于猪传染性胸膜肺炎的快速诊断.     

锦州地区猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

[目的]调查锦州猪传染胸膜肺炎的流行情况。[方法]从锦州部分发病猪场采集病料5份,通过细菌的分离培养、生化试验、卫星现象观察,溶血试验、CAMP试验、药敏试验和动物接种试验对致病菌进行分离与鉴定。[结果]该病原菌为革兰氏阴性短小杆菌,无芽孢,具有多形性。分离到5株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,均有卫星现象和溶血现象。CAMP试验结果表明,金黄色葡萄球菌可增强其溶血圈。5株分离菌对头孢拉定、先锋V、氟哌酸高度敏感,而对阿莫西林、链霉素、青霉素、金霉素有耐药性。动物接种试验表明该致病菌对家兔具有较高的致病力。[结论]该研究可为猪传染性胸膜肺炎的临床治疗提供依据。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与药敏试验

从苏北地区某疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪采集病料,经细菌分离培养得到3株分离株,分别命名为YC01、YC02、YC03。经形态学检查、CAMP试验、卫星生长现象、尿素酶试验鉴定,3株分离菌均为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌。药敏试验显示,3株分离菌对头孢噻肟、氟苯尼考及由板蓝根、麻黄、连翘等组成的中药复方高度敏感。采用高敏药物对某感染猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的商品猪场进行治疗,结果表明,板蓝根、麻黄、连翘等组成的中药复方水提物口服与头孢噻肟肌肉注射联用对控制猪传染性胸膜肺炎死亡有较好效果。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的血清型鉴定与药敏试验

从江苏泰州地区疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪采集病料,经细菌分离培养得到了3株分离株TZA1、TZA2和TZA3株。经形态学检查、CAMP试验、生化试验和血清型鉴定,确定TZA1株和TZA2株为血清1型,TZA3株为血清3型。药敏试验显示,3株分离菌株对恩诺沙星、阿齐霉素、头孢唑肟高度敏感。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定

从江西省猪场病死猪肺脏中分离到三株胸膜肺炎放线杆菌。本试验对分离菌株的理化特性进行了测定，并用分离菌株制备了灭活疫苗，有效控制了菌株分离场的猪传染性接触性胸膜肺炎。     

血清7型猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分离鉴定与耐药性分析

为确定皖西地区某规模化猪场疑似猪传染性胸膜肺炎的病原及有效治疗药物,对患病猪进行临床症状观察、病死猪病理解剖及病原分离;对分离菌进行形态学观察、生理生化特性测定,敏感药物筛选及药物治疗。结果显示,从猪鼻腔分泌物和肺脏组织中分离到形态一致的优势菌株,经纯化培养后命名为WXC1901;菌株WXC1901能利用葡萄糖、蔗糖、木糖、果糖,硝酸盐还原、脲酶、氧化酶和接触酶试验均为阳性,其他生化指标均为阴性,结果与猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)生理生化特性一致;血清学鉴定为血清7型APP;药敏试验结果显示,菌株WXC1901对β-内酰胺类药物氨苄西林和多肽类药物万古霉素、多粘菌素B敏感,对环丙沙星、头孢他啶、麦迪霉素和复方新诺明等药物耐药;经选用氨苄西林治疗,同时结合对症治疗和提高猪体免疫力治疗等方法,连续治疗5 d后,患病猪基本痊愈。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌变异株的分离与鉴定

对江苏泰兴某猪场疑似猪传染性胸膜肺炎病料进行实验室分离培养,成功分离到1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌,并对其进行生化特性、双抗夹心ELISA鉴定。为进一步分析该分离株的血清型,针对ApxIVA和ApfA保守基因设计2对检测引物,PCR结果表明:该分离株未扩增出预期大小的片段,说明该分离株很有可能是1株猪传染性胸膜肺炎放线杆菌变异株,其血清型还有待进一步鉴定。     

猪胸膜肺炎放线杆菌的分离与鉴定

从陕西某养猪场表现呼吸困难、下痢及肺炎病变的３月龄病猪检出弓形虫滋养体并分离到一致病菌。该菌表现出形态多样性、革兰氏染色不定和形成从琼脂表面难以移取的菌落等特点，小鼠试验显示有毒力。药敏试验表明，该菌对痢特灵、氯霉素高度敏感。系统的生物学特性鉴定表明，该分离菌为胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｕｓｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌分离鉴定及floR基因检测

为探究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)临床分离株对氟苯尼考(FFC)的耐药性及floR基因的流行与分布情况,收集河南、湖北、江西、陕西、湖南、山西、安徽等7个省份合作猪场送检的病死猪肺脏、脾脏、支气管黏液等206份病料样本,从中分离APP并鉴定,采用微量肉汤稀释法测定分离菌株对FFC的敏感性,PCR及测序方法检测floR基因,并用随机引物PCR(AP-PCR)方法分析临床分离菌株之间的同源性。结果表明,成功分离鉴定了APP 28株,分离率为13.59%。4株APP对FFC耐药,耐药率为14.29%;15株携带floR基因,floR检出率为53.57%,高于APP对FFC的耐药率;有11株分离菌floR阳性但对FFC并不耐药。分析RAPD系统树状图发现,28株APP被分为几乎无核苷酸同源性的A和B 2大类、25种RAPD型,其中A类25株,分22种RAPD型,14株携带floR基因,这些菌株间的核苷酸同源性为40%～80%;B类3株,分3种RAPD型,1株携带floR基因。本研究提示APP的floR基因主要以水平方式传播。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌江西株的分离鉴定及PCR诊断

从江西南昌地区一些猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎放线杆菌典型病例中,采集病猪的病变组织,经细菌分离得到3个分离菌株JXAV-AIII0611、JXAV-AVII0611、JXAV-AX0611,经涂片染色镜检、培养性状观察、生化鉴定以及药敏试验证实该致病菌为猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)。同时利用APP的oml基因设计引物,通过PCR成功扩增出预期的基因片段,为快速诊断该病打下了基础。     

用PCR检测猪胸膜肺炎放线杆菌

为了快速诊断猪的传染性胸膜肺炎，试验设计合成了1对引物，建立了检测猪胸膜炎肺放线杆菌的PCR方法，猪胸膜炎肺放线杆菌Ⅰ型菌血清2、5、6、9、10型均能扩增出预期片段；大肠杆菌，猪痢疾蛇形螺旋体、多杀性巴氏杆菌、鸡葡萄球菌和支气管败血性波氏杆菌的扩增结果均为阴性，用该方法检测了自猪肺脏分离的30个菌株，有11株为阳性，19株为阴性，结果证实，本方法可以用于猪胸膜肺炎的快速诊断。     

不同NAD含量条件下培养的猪胸膜肺炎放线杆菌对小白鼠致病性和免疫保护性的影响

将在含体积分数为0.050%、0.001%的尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的LB培养基中培养的血清5型猪胸膜肺炎放线杆菌(APP),分别以3×109CFU.只-1的菌量对30日龄小白鼠进行接种,观察不同NAD含量条件下培养的APP对小白鼠致病性的影响.结果表明:用0.001%NAD培养的血清5型APP对小白鼠的致病性较强,小白鼠接种APP后,多数表现肺脏严重出血;而用0.050%NAD培养的血清5型APP接种小白鼠后,只有少数小白鼠肺脏出血严重,多数表现为轻度出血.将上述条件培养的APP按常规方法制备油乳剂灭活疫苗,分别在第3周龄和第6周龄对小白鼠进行免疫接种,在2免后3周对免疫的小白鼠进行同源攻击,并对免疫前后小白鼠的抗体效价进行检测.结果表明:分别用0.050%、0.001%NAD培养的血清5型APP制备的灭活疫苗,对小白鼠的保护率差异不显著;用0.001%NAD培养的血清5型APP制备的灭活疫苗免疫小白鼠,用血清5型APP同源攻击后,发病的小白鼠肺脏出血较轻,而用0.050%NAD培养的疫苗免疫小白鼠攻毒后,发病的小白鼠肺脏出血严重.可见在不同NAD含量条件下培养的APP对小白鼠的致病性和免疫保护力不同.     

胸膜肺炎放线杆菌诊断抗原的制备及初步临床应用

利用14个血清型的胸膜肺炎放线杆菌的标准菌株制备诊断抗原，通过玻片凝集试验，琼脂扩散试验和对流免疫电泳，以标准抗血清作为参考，检验各种诊断抗原的灵敏性和特异性。分别用凝集抗原、超声波处理抗原和酚水抗原对来自湖北、湖南、江西、河南、安徽5省猪场的155份送检血清进行检测。结果表明可以对送检血清快速、准确地进行鉴别诊断和血清分型。     

Cloning and Expression of Actinobacillus pleuropneumoniae Gene Coding for TbpA and Development of an Indirect TbpA-ELISA

This study presents the cloning and expression of gene encoding transferrin-binding protein A from Actinobacillus pleuropneurnoniae in Escherichia coli expression system and the development of an indirect TbpA-ELISA. The gene coding TbpA was amplified from the A. pleuropneumoniae serotype 2 genome using polymerase chain reaction and cloned to pET-28b expression vector under the control of strong, inducible T7 promoter. The recombinant plasmid was expressed in E. coli BL21 （DE3）. The expressed fusion protein was analyzed using SDS-PAGE and Western blotting. The diagnostic potential of recombinant TbpA （rTbpA） was evaluated through an antibody-detection indirect ELISA based on the purified rTbpA. The TbpA antibodies were detectable in mice on day 7 after vaccination with purified rTbpA protein or infection with A. pleuropneumoniae serotype 10 with the TbpA-based ELISA. In addition, the TbpA-ELISA was able to detect 12 serotyping rabbit antisera postinoculation （PI） with A. pleuropneumoniae 12 serotypes experimentally. The comparable result was obtained by detecting the 117 clinical serum samples using, respectively, the TbpA-ELISA and indirect hemagglutination test （IHA） based on multiplex antigen. The result indicates that the TbpA-ELISA was the more sensitive method compared with the Mix-IHA method because of its consistent presence in A. pleuropneumoniae serotypes. In conclusion, the conserved TbpA of A. pleuropneumoniae can be used for the development of a cross-serotype diagnostic method for the detection of antibodies against A. pleuropneurnoniae.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌磺胺类药物耐药基因的检测

为了解河南省及周边地区规模化猪场猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)对磺胺类药物的耐药情况,本研究从河南省及周边地区49个规模化猪场的肺脏和气管中分离出79株疑似APP菌株,血清型鉴定结果显示,分离菌株为1、2、3、5、7、8、9、10型APP,采用纸片扩散法对分离株进行了耐药表型鉴定,同时采用PCR方法对磺胺类药物耐药基因进行了检测。药敏试验结果显示,APP对磺胺类药物的耐药率为100%(79/79)。根据Gen Bank中登录的序列,设计了3对特异性引物,对磺胺类药物的耐药基因Sul1、Sul2、Sul3进行扩增检测。耐药基因检测结果显示,分离的79株细菌中,Sul2基因检出率为100%(79/79),Sul1基因的检出率为79.75%(63/79),Sul3基因的检出率为89.87%(71/79),Sul1和Sul2基因同时检出率为70.89%(56/79),Sul1和Sul3同时检出率为62.03%(49/79),Sul2和Sul3基因同时检出率为77.22%(61/79)。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的原核表达

经PCR从含有OML基因片段的重组质粒App-OML-1中扩增出mAppOML-1基因,同时对目的基因和表达载体pPRoEX HTb进行酶切、连接、转入E.coliBL21,构建重组质粒pPRoAppOML-1.阳性克隆用IPTG进行诱导,经SDS-PAGE电泳鉴定,表达的融合蛋白分子质量约为45 ku,Western-blotting分析表明表达的目的蛋白具有良好的反应原性.     

二温式PCR检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌方法的建立与应用

为了探索简便、快速确诊猪传染性胸膜肺炎的方法,根据猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)apx IV基因序列,设计合成1对特异性引物,建立聚合酶链反应(PCR)检测APP的方法。采用该方法对APP和其他6种猪病病原核酸进行检测,结果只对APP扩增出与预期大小相符的422bp DNA片段,而对其他6种猪病病原核酸的扩增结果为阴性。该PCR最低可检出10pg的APP DNA。对送检的46份可疑病猪组织进行检测,结果有19份样品为阳性,27份为其他病原感染。