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鲤鱼HSP70基因组织表达差异研究 总被引:2,自引:0,他引:2
1材料与方法
1.1材料 供试鲤鱼购自成都市洗面桥市场。主要试剂:TR—Iaol总RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司,反转录试剂盒、pMD-18T载体、D12000DNA和如DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司;DEPC原液(Sigma分装)、JM-109感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司,其他试剂均为国产分析纯。 相似文献
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农杆菌介导油菜油体基因与碱性成纤维细胞生长因子融合基因转化油菜研究 总被引:5,自引:2,他引:3
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试材料。白菜型油菜苏州青,市售。
1.1.2菌株及质粒。采用根癌农杆菌LBA4404,该菌株含有植物双元表达载体pCAMBIA1390,油菜油体基因与bFGF的融合基因已整合到该载体上,该融合基因由油菜油体基因启动子启动。植物基因组提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司,Southern检测试剂盒为DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I,购于Roche公司。 相似文献
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[目的]研究靶向PRRSV核衣壳蛋白N基因的siRNA表达载体的构建及鉴定:[方法]设计并人工合成靶向PRRSV核蛋白N基因的3个siRNA靶序列,将其插入CMV启动子下游,克隆到真核表达载体pSilencer4.1-CMV中,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA测序。[结果]成功构建了靶向核蛋白基因表达的siRNA干扰重组质粒载体pSilencer—N。[结论]该研究为进一步运用RNA干扰技术进行PRRSV防治研究奠定了基础。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]克隆猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因并在原核表达系统中表达。[方法]根据GenBank上登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物,用RT—PCR方法扩增出PRRSV的核衣壳蛋白(N)基因,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T.1上,得到重组质粒pGEX-4T-1-N。将重组质粒转化大肠杆菌BL31(DE3)感受态细胞,经TPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测。[结果]PRRSV肺组织所提取的RNA,经RT—PCR扩增,得到一段392bp的片段,与预期结果一致。SDS—PAGE电泳分析,所得重组蛋白的分子量约39.866Da,与预期结果相同。重组菌体超声裂解后,经10%的SDS—PAGE电泳分析,结果显示该重组蛋白为可溶性蛋白。 相似文献
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以猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组核衣壳蛋白(rN蛋白)为抗原,初步建立了检测PRRSV抗体的rN-ELISA方法。根据GenBank公布的PRRSV VR2332株编码核衣壳蛋白的ORF7基因序列设计合成了一对引物,成功扩增出ORF7基因。将其克隆到PET-30a构成原核表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)并获得表达。通过SDS-PAGE和Western blot检测证实rN蛋白获得了高效表达,且具有良好的免疫学活性。以纯化的重组蛋白为抗原建立检测PRRSV抗体的间接ELISA法。试验证明,该方法与IDEXX公司生产的PRRSV抗体检测ELISA试剂盒对同批临床血清样本的检测结果完全相符,且对其他常见的6种猪疫病阳性血清检测均为阴性,无交叉反应。本研究建立的rN-ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征常规诊断及流行病学的调查研究。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析 总被引:9,自引:1,他引:8
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)为不分节段、聚腺苷酸化、有囊膜的单股正链RNA病毒。其基因组长约15kb,含有8个开放的阅读框架(ORFs)。PRRSV基因组的顺序依次为:5’-ORFla-ORFlb-ORF(2—6).ORFT-3’。鲁韦韦等分析表明,PRRSV的ORF7基因保守性较好,变异较小。此外,ORF7编码的核衣壳蛋白(N蛋白)具有良好的免疫原性及反应原性,机体产生的PRRSV抗体主要是针对N蛋白的。因此,N蛋白常可作为诊断抗原来检测PRRSV。 相似文献
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利用哺乳动物细胞表达系统对禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白进行表达,并检测所表达融合蛋白的抗原性。首先将N基因克隆到真核表达载体pEGFP-C1中,构建重组真核表达载体,然后将阳性重组质粒转染BHK-21细胞,通过倒置荧光显微镜和共聚焦显微镜检测N蛋白的表达,并用Western blot检测表达蛋白的抗原性。结果显示,禽偏肺病毒核衣壳N蛋白主要表达在细胞浆中,在转染后48h后表达量最高;与抗N蛋白抗体有抗原性,所表达核衣壳N融合蛋白大小为72kDa左右,与预期结果一致。结论,本试验成功应用哺乳动物表达系统表达了禽偏肺病毒C型核衣壳N蛋白,表达蛋白具有抗原性,为与禽偏肺病毒核衣壳N蛋白的相关研究奠定了基础。 相似文献
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靶向Annexin A3短发夹环RNA干扰载体的构建及鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]利用RNA干扰(RNA interfering,RNAi)技术构建和鉴定膜联蛋白A3(Annexin A3)的真核表达载体,为进一步研究Annexin A3在肝细胞中的功能奠定基础。[方法]人工合成3对shRNA序列,退火后定向克隆到真核表达载体psiRNA-hH1neo上,采用酶切和测序法鉴定。[结果]质粒酶切及测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致。[结论]成功构建膜联蛋白A3靶向的真核表达载体。 相似文献
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猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的表达和重组蛋白的纯化及免疫学活性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
[目的]在基因工程菌中实现猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF7基因的高效表达,对表达的重组蛋白进行纯化,并探讨其免疫学活性及应用价值。[方法]将已构建好的重组表达载体pET-ORF7转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG在最适条件下诱导表达,其表达产物用SDS-PAGE和Western Blot进行检测。应用Ni-NTAHis.Bind Resin层析柱在变性条件下纯化表达产物,通过梯度透析进行复性。采用Western Blot及间接ELISA法检测复性后重组蛋白的免疫学活性。[结果]重组质粒pET-ORF7在大肠杆菌中以融合形式成功表达,融合表达产物主要以包涵体形式存在。SDS-PAGE检测所表达的重组蛋白分子量为33 kD左右,与预期大小相符。Band-scan软件对表达蛋白分析发现,表达产物约占菌体蛋白的50%。Western Blot及间接ELISA法显示复性后的重组蛋白与PRRSV阳性血清有特异性结合反应,表明其具有良好的免疫学活性。[结论]该试验将为进一步研制PRRSV单克隆抗体及诊断试剂盒奠定基础。 相似文献
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为了提高猪生殖与呼吸综合征病毒山东株(PRRSV SD2株)基因免疫的效果,将PRRSV SD2 E基因插入哺乳动物表达载体PVAX1中,构建出PVAX1-E质粒。再将已筛选出的CpG-ODN序列通过在其两端的粘性酶切末端定向插入含PVAX 1-E的真核表达载体,构建含CpG基因序列真核重组表达质粒CpG-pVAX 1-E。将重组质粒转染COS-7细胞,经RT-PCR检测E基因mRNA的转录和间接免疫荧光试验(IFA)证实:CpG-pVAX 1-E可表达PRRSV GP5蛋白。试验结果为进一步研究PRRSV SD2 ORF5动物免疫反应奠定基础。 相似文献
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[目的]通过构建靶向14-3-3ζ的siRNA及其报告基因EGFP的重组腺相关病毒载体,包装出含有目标基因的腺相关病毒。[方法]设计靶向14-3-3ζ的siRNA,插入到psiRNA质粒H1启动子下游,Western-Blot检测siRNA的抑制效果。从psiRNA质粒上扩增H1-si-ζ基因表达单位亚克隆到AAV表达质粒AAV-MCS-EGFP的Mlu1酶切位点,构建重组质粒pAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper用磷酸钙法共转染AAV-293细胞制备重组病毒rAAV-14-3-3ζ-EGFP。重组病毒感染HT1080细胞,荧光显微镜检测病毒介导的EGFP表达。[结果]通过酶切鉴定和测序确定重组病毒载体pAAV-14-3-3ζ-EGFP已构建成功。病毒感染的细胞中检测到绿色荧光,表明重组病毒成功包装。[结论]成功包装出重组腺相关病毒AAV-14-3-3ζ-EGFP,为今后利用腺相关病毒载体进行14-3-3ζ相关的体内、外研究提供了试验基础。 相似文献