镰刀菌ISSR标记体系的建立及遗传多样性分析

 【目的】建立镰刀菌ISSR反应体系和进行镰刀菌的ISSR遗传多样性分析。【方法】利用ISSR-PCR技术,对影响PCR扩增效果的一些因素和ISSR引物进行筛选和优化,通过聚类分析图对镰刀菌遗传多态性进行研究。【结果】镰刀菌ISSR-PCR分析最适宜的反应条件是以UBC885为引物,在20 μl反应体系中,2.0 mmol?L-1 Mg2+,0.5 U Taq DNA聚合酶,0.2 mmol?L-1 dNTPs,0.4 μmol?L-1引物,30 ng的DNA模板,退火温度为52℃。通过对27株镰刀菌进行了ISSR的遗传多样性分析,选用的11个引物共扩增出79个DNA片段,其中多态性位点为65个,占总扩增片段的82.3%。依据扩增结果进行遗传相似性分析,构建了分子树状图。聚类分析结果表明,供试的27株镰刀菌的遗传相似系数在0.672～0.950,在0.67水平上,可分为3个类群,2个亚类群。【结论】建立了适合镰刀菌ISSR-PCR分析的反应体系;ISSR标记技术在镰刀菌种间和种内都表现出明显的遗传差异性,此技术可用于镰刀菌遗传多态性的分析研究。     

大叶栎ISSR扩增体系的优化

[目的]探讨影响大叶栎ISSR扩增效果的因素,建立大叶栎ISSR扩增的优化体系。[方法]以新嫩的大叶栎叶片为试材,采用改良CTAB法提取大叶栎叶片基因组DNA,并将DNA浓度稀释到30ng／μl,采用单因素试验设计测试DNA模板、PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶的用量以及底物dNTP终浓度和引物终浓度对ISSR扩增的影响。[结果]大叶栎的ISSR扩增的最优反应体系为：总体积20μl中含有DNA模板60ng、PCR缓冲液10×buffer为2．0μl,底物dNTP终浓度为0．25mmol／L,引物终浓度为0．3μmol／L,TaqDNA聚合酶为1U。在该体系下,能够扩增出清晰、多态性高的条带,能够满足大叶栎种群ISSR多样性分析的要求。[结论]建立了大叶栎ISSR扩增的优化体系,为研究广西的大叶栎种群遗传多样性提供了技术基础。     

基于ISSR标记的20种荷花品种资源遗传多样性分析

[目的]研究20种荷花材料遗传多样性和亲缘关系。[方法]利用ISSR-PCR体系筛选出16条多态性引物,并利用16条ISSR引物对20种荷花材料进行PCR扩增。[结果]16条引物扩增出225个位点,多态性位点占75.56%。通过Popgene32软件计算出20个荷花品种间的相似性系数为0.577 8~0.951 1,平均值为0.779 6。通过聚类分析将20个荷花品种分为两大类,白洋淀红莲和冬瓜莲可归为一类,其他18个品种划分为第二类。[结论]ISSR标记技术可有效应用于不同荷花品种的遗传多样性分析和亲缘关系的鉴定。     

甜瓜种质资源遗传多样性ISSR分析

[目的]对甜瓜种质资源遗传多样性进行ISSR分析。[方法]以27份甜瓜品种为材料,对其基因组DNA进行ISSR分析,计算它们之间的遗传相似系数并进行聚类分析。[结果]从69个ISSR引物中筛选出9条扩增谱带清晰、反应稳定的引物,共扩增出73条条带,其中56条为多态性条带,平均每个引物6.2条。品种间遗传相似系数在0.65～0.97间,表明这27份甜瓜品种间的遗传基础相对较狭窄。利用UPGMA聚类分析,以相似系数0.65为标准,将27份甜瓜种质划分为薄皮甜瓜和厚皮甜瓜2大类群;以相似系数0.80为标准,将薄皮甜瓜分为7个亚类群。[结论]为遗传背景相对狭窄的甜瓜品种选育工作提供了分子水平上的依据。     

青海云杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化

[目的]确定适应青海云杉ISSR-PCR反应的最佳反应体系。[方法]以青海云杉（Picea crassifolia kom.）为材料,对影响其ISSR—PCR扩增结果的各因素（Mg^2＋、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物、退火温度）进行筛选和优化。[结果]青海云杉ISSR—PCR最佳反应体系为在20山反应体系中包含1μl 10×buffer,1．5mmol／L的Mg^2＋ 0．2mmol／L的dNTPs,TaqDNA聚合酶1．0U,模板DNA 40ng,引物0．6μmol／L。对青海云杉ISSR-PCR最佳反应体系的退火温度进行梯度试验发现,引物UBC818的最适退火温度为54．2℃,且最适退火温度因引物而异。[结论]该优化ISSR．PCR反应体系的建立,为今后利用ISSR技术进行青海云杉种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

荔枝ISSR扩增条件优化

对ISSR—PCR扩增荔枝基因组DNA的主要影响因子进行了筛选和分析。试验结果表明：20μl的反应体系中采用20ng的模板DNA，0．15μmol／L ISSR引物、1．25U Taq DNA聚合酶，0．15μmol／LdNTP，以及50～54℃的复性温度为荔枝1SSR。PCR扩增条件的最佳选择。     

珍稀濒危植物大果木莲ISSR-PCR反应体系的建立

[目的]建立高效稳定的大果木莲ISSR—PcR反应体系。[方法]以珍稀濒危植物大果木莲新鲜嫩叶为材料,在高盐沉淀法提取高质量基因组DNA的基础上,通过ISSR—PcR反应体系中5个主要因素的单因子梯度试验,优化并最终建立了大果木莲稳定而高效的ISSR—PCR反应体系和反应程序,[结果]试验建立的大果木莲的ISSR—PCR反应体系为：20．0山反应体系中含10×buffer2．0Ixl、Mg2＋2．0mmol/L、Taq酶0．5U、DNA模板40ng、引物O．8μmol／L、dNTPs0．2mmol／L和ddH2O13．3μl,其反应程序为：94℃预变性5min;94℃变性1min,50～60℃退火45s,72℃延伸2min,40个循环;72℃完全延伸7min。[结论]该研究为进一步揭示大果木莲群体的遗传多样性和遗传结构状况以及制定科学的保护措施提供了理论依据。     

高原鼠兔ISSR引物反应体系的优化与筛选

[目的]筛选和优化高原鼠兔(Ochotona curzoniae)适宜的ISSR反应体系,以在对高原鼠兔进行ISSR分析时获得清晰和多态性好的扩增结果。[方法]以高原鼠兔基因组DNA为模板,通过单因素试验,对体系中的模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶用量、引物用量、退火温度进行探讨。[结果]结果表明,高原鼠兔ISSR-PCR扩增的最佳条件为:25μl PCR反应体系,其中4lμDNA模板,1.5 mmol/LMgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1.25 UTaq聚合酶,1.5μmol/L引物,复性温度4560℃(退火温度随引物不同而确定)。用11条引物进行了PCR扩增,筛选出效果较好的6条引物。[结论]该反应体系的建立为鼠兔遗传多样性和分子系统学研究提供技术支持。     

梅花宫粉品种群品种遗传多样性的ISSR分析

利用ISSR标记对梅花60个宫粉品种群品种进行了遗传多样性和亲缘关系分析,11个引物共扩增出106条DNA片段,其中多态性DNA带为93条,占总扩增片段的87.7%。引物扩增DNA片段数在6～13条之间,平均每个引物扩增DNA带数为9.6,扩增DNA片段大小在220～2500bp之间;品种间Nei's遗传距离介于0.081～0.543之间,显示宫粉品种群品种间的遗传差异较大;根据ISSR扩增结果,利用UPGMA法构建树状聚类图,聚类分析将60个品种分为2类,聚类群与品种来源有明显的相关性。     

三角帆蚌ISSR-PCR优化反应体系的建立

采用ISSR技术对三角帆蚌基因组DNA进行PCR扩增,筛选、分析了ISSR—PCR扩增时的主要影响因子,包括Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度、酶浓度、甲酰胺浓度等,建立了三角帆蚌的ISSR—PCR优化反应体系,为进一步研究三角帆蚌种质资源状况奠定基础。最终确立的适用于三角帆蚌ISSR扩增的25μl反应体系为：MgCl2 1．5mmol／L,dNTPs 0．2mmol／L,引物0．2μmol／L,Taq酶1．0U,甲酰胺1％,DNA模板量约50ng。     

板栗ISSR反应体系的优化及河北省板栗生态型的分析

以早丰和燕明2个板栗品种为试材,应用编号为ISSR52的引物,对ISSR反应体系中的dNTPs、TaqDNA聚合酶、引物、模板和甲酰胺等主要影响因子进行了优化筛选。结果表明：20μLISSR反应体系各组分的最适浓度分别为1×Buffer（含2．0mmol／L的Mg^2＋）,dNTPs0．2mmol／L,TaqDNA聚合酶1．0U,引物0．2μmol／L,模板25ng。加入2．0％的甲酰胺有利于减轻背景的干扰。利用该体系对9个河北省板栗品种（系）和1个山东省板栗品种进行了分析,以明确河北省板栗居群的遗传多样性。通过对53个ISSR引物的重复筛选,获得了19个稳定的ISSR引物,在10个品种（系）中共产生93条带,33．3％为多态性务带。通过聚类分析进一步明确河北省板栗可分为燕山和太行山2个生态型,并且太行山地区的板栗具有较高的遗传多样性。     

新疆梨种质资源亲缘关系的ISSR和RAPD分析

[目的]探讨新疆梨种质资源亲缘关系以及遗传多样性,旨在为供试梨资源的分类提供科学依据.[方法]采用ISSR和RAPD分子标记对48份梨种质资源进行聚类分析和遗传关系研究.[结果]14条ISSR引物共扩增出113条清晰的谱带,其中101条显示多态性,平均每个引物扩增出7.2条多态性谱带.19条RAPD引物共扩增出163条清晰的谱带,其中多态性谱带138条,平均每个引物扩增出7.2条多态性谱带.基于ISSR和RAPD两种标记,利用UPGMA分别构建了48份梨资源的聚类树状图.ISSR和RAPD分别聚类以及两种标记混合聚类均将48份梨种质分为3类:第Ⅰ类群中包括1份种质;第Ⅱ类群中包括23份种质;第Ⅲ类群中包括24份种质.[结论]两种标记适合于梨种质资源亲缘关系和遗传多样性分析,可为梨资源的开发利用及新品种的选育提供科学依据.     

油棕新品种遗传多样性的ISSR分析

[目的]从DNA分子水平上对油棕新品种进行遗传多样性的分析,为这些新选育油棕种质的开发利用提供分子水平的理论依据。[方法]应用ISSR技术对海南和云南的22份油棕新品种进行遗传多样性分析。[结果]用23个引物共扩增得到201条扩增条带,其中多态性条带占41.8%。聚类分析可将22个品种明显的划分为2大类：采自海南的R1～R12新种质材料与采自云南的V20新种质材料聚为一类;采自云南的其余新种质材料聚为一类。[结论]海南与云南新选育的油棕种质材料可能来源于不同的国家或地区。     

云南特有茶组植物遗传多样性的ISSR研究*

 以云南茶组植物为材料,利用ISSR技术对云南茶组植物进行了遗传多样性分析。从所筛选出的12个引物对25份供试材料进行ISSR扩增反应后,共产生141条谱带,其中多态性谱带为139条,其多态条带比率(PPB)高达98.5%,表明25份材料具有丰富的多态性。并根据遗传距离利用UPGMA构建了云南茶组植物亲缘关系树状聚类图。25个材料可分为6个类群(取值水平GD=0.378 ),20个茶组植物分为2个类群。从DNA分子水平探讨了云南茶组植物的遗传多样性,突出了种间的遗传差异,种间的遗传距离为0.151~0.580,表明25份材料间遗传基础较宽。PCA分析与聚类分析结果基本一致。结果显示,ISSR作为一种信息量高、重演性好的分子标记,应用于茶树品种鉴别和亲缘关系分析是非常有效的。     

正交优化设计蒙药阿给ISSR-PCR反应体系

[目的]建立适用于蒙药阿给（Artemisia frigidaWilld.）的ISSR反应体系,为ISSR标记技术在蒙药阿给遗传多样性研究中的应用奠定技术基础。[方法]利用正交试验设计,从Mg^2＋、dNTP、TaqDNA聚合酶和引物浓度4因素3水平,对蒙药阿给ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对PCR的循环次数及退火温度进行试验。[结果]在20μl反应体系中,Mg^2＋为1.5mmol/L,dNTP为0.25mmol/L,TaqDNA聚合酶为1.5U,引物为0.75μmol/L时,且ISSR最适的循环次数为40,最适退火温度为56.0℃,扩增效果最好。[结论]筛选出的反应体系适用于蒙药阿给的ISSR扩增。     

福州市主栽橄榄品种与若干鲜食橄榄优株的ISSR分析

采用ISSR-PCR分子标记技术对19个橄榄种质资源的遗传多样性进行分析,探索甜榄与福州市主栽橄榄品种遗传背景的差异。从40条ISSR引物中筛选出8条引物用于PCR扩增,共扩增出110条带,其中多态性条带78条,多态性比率为70.91%,平均每个引物扩增的DNA条带的数目为14条。应用SPSS 13.0软件计算各品种间的Jaccard相似系数,结果显示橄榄间的相似性系数介于0.429～0.873,平均遗传相似系数为0.656。用UPGMA聚类法,在遗传距离为0.635的水平上,可将19个品种(优株)分为4组,鸿尾6号和马坑10号为一组,闽清7号和闽清8号则分别独立为一组,其余的归于一组。16个甜榄优株遗传背景差异较大,说明现有的甜榄并非来源于某个品种。该研究可为甜橄榄资源的开发利用及新品种的选育提供科学依据。     

用ISSR标记分析甜荞栽培品种的遗传多样性

[目的]研究用ISSR标记分析甜荞栽培品种的遗传多样性。[方法]采用ISSR分子标记对来自11个省的90份甜荞种质的遗传多样性进行了分析。[结果]19条ISSR引物共扩增出508条条带,平均26.7条;其中多态性条带462条,平均24.3条,多态性带的百分率为90.1%。Nei’s遗传相似系数在0.67~0.95。UPGMA聚类分析显示,聚类结果与地理来源有较强的一致性,来自辽宁、内蒙古、陕西、四川、甘肃等省的甜荞都是按来源各自聚为一类,但是发现了几个特殊的类型,即来自河北的甜荞E、安徽的82F以及辽宁的辽荞37号均单独聚为一类。不同地区材料之间的多态性信息指数（PIC）差异较大,其中,辽宁的最高,为0.842,内蒙古的最低,为0.633。[结论]采用ISSR分析甜荞遗传多样性,甜荞表现出丰富的多态性,表明可以用ISSR标记对甜荞进行分子水平的鉴定和遗传多样性分析。