RNAi技术的研究及其在植物上的应用

RNA干扰（RNAi）是由双链RNA导入而引起的基因沉默现象,它可以在转录水平、转录后水平对基因的沉默发挥作用。就RNAi的发展历史、作用机制、特征及其在植物抗病毒、品质改良和基因功能研究中的应用作一概述。     

RNA干扰及其在植物研究中的应用

RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是双链RNA诱导的转录后基因沉默。RANi在生物体内普遍存在,且高度保守,被生物学家誉为生物体在基因组水平上的免疫系统。随着RNAi机制研究的不断深入,RNA干扰作为一种高效的、序列特异的基因沉默,可在植物基因功能分析、农作物基因组改良和植物抗病毒研究等方面发挥重要作用。     

RNA干扰的研究进展

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA诱发的转录后水平的基因沉默现象,是近几年发展起来的基因表达调节新机制,广泛地存在于真菌、植物和动物中。主要介绍了RNAi的发现、分子机制、转基因载体构建策略以及RNAi在生命科学中广阔的应用前景。     

RNA沉默在植物与根结线虫互作基因研究中应用

基因沉默或RNA干扰（RNA interferance,RNAi）是双链RNA诱导的序列特异性基因沉默,是转录后水平上对基因的表达进行负调控。随着植物与根结线虫相互关系的研究的深入以及基因工程技术的发展,揭示了基因工程方法防治线虫危害的新途径。最近研究表明,dsRNA基因在植物体内表达,线虫取食这种转基因植物后线虫致病力下降并使植物有效抵抗多种根结线虫。这种转基因植物具有有效低抗线虫危害特性,而且其抗性是广谱的。该文对RNAi的研究历史、植物根结线虫抗性基因以及RNAi技术防治根结线虫的新途径等方面的研究进展进行了综述。     

RNA干涉技术研究进展

RNA干涉是由双链RNA引起的转录后基因沉默机制.RNAi作为一门新的基因沉默技术,具有序列特异性和高效性等许多优点,在基因功能研究、疾病治疗、药物开发等方面具有广泛的应用.综述RNAi现象的发现、发生机制及其应用,并展望未来的研究.     

PTGS/ RNAi的作用机制及其应用

论述了双链RNA对同源基因的表达进行特异性的封闭而引起的转录后的基因沉默(PTGS/ RNAi)现象,PTGS/RNAi的作用机理,作用模型,参与这一过程的酶、基因、起始因子和作用因子．介 绍了PTGS/RNAi在基因组功能研究、基因的时空表达调控以及在作物改良等方面的应用。     

siRNA对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)复制的影响

RNA干涉(RNAi)可以通过短双链RNA(siRNA)介导,特异地降解相应的mRNA,从而抑制基因表达,导致转录后水平的基因沉默(PTGS)。本研究利用这种技术,将鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染体外培养的Vero-E6,使其适应Vero-E6,然后用体外转录合成的针对IBV部分基因的siRNA,对其复制进行RNAi。结果显示,针对IBVM蛋白的siRNA能有效地抑制IBV在Vero-E6细胞中的复制。     

植物中RNA干扰技术的研究与应用

RNA干扰(RNAi)是与靶基因同源的双链RNA引发的,在真菌、植物和动物中普遍存在的序列特异的转录后基因沉默(PTGS)现象。该方法的研究是目前分子生物学和基因工程领域研究的热点之一。作为反向遗传学研究的新工具,RNAi在基因功能研究、基因治疗以及病毒防治等方面发挥着巨大的作用,文章将RNAi的发现、作用机理、特点、导入思路和方法及其在植物中的广泛应用进行了综述。     

棉花VIGS病毒载体的构建及其在抗病基因功能鉴定的应用

【目的】利用农杆菌介导的VIGS基因沉默技术,研究陆地棉抗病相关基因在棉花抗黄萎病中的功能。【方法】利用分子生物学技术构建VIGS病毒载体,建立VIGS病毒诱导沉默体系;利用此体系将棉花中的一个钙依赖蛋白(CDPK)基因,通过农杆菌介导在陆地棉中沉默,根据此基因沉默植株在病原菌环境下的发病情况研究该基因在棉花抗病中的功能。【结果】利用包含有GhCPK抗病基因片段的VIGS病毒载体的农杆菌侵染棉花子叶,病毒载体上的目的基因片段由RNA聚合酶识别并合成双链RNA(double stranded RNA,dsRNA),dsRNA由Dicer酶识别并于其它RNA形成RNA诱导的沉默复合体(RNA induced silencing complex, RISC),RISC对内源GhCPK mRNA进行识别和切割作用,内源GhCPK mRNA降解而发生基因沉默。GhCPK基因沉默导致棉苗对黄萎病敏感性增加,证明GhCPK基因参与调控棉花抗病功能。【结论】病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)能够快速有效的研究GhCPKs基因在棉花抗病中的功能。     

植物转基因沉默的机制及克服方法

植物转基因沉默可以发生在染色体DNA、转录和转录后3种不同的层次上,转录水平基因沉默机制涉及DNA甲基化、位置效应、重复序列和同源序列等的作用,转录后水平基因沉默机制常用RNA阈值模型、异常RNA模型、双链RNA模型和未成熟翻译终止模型等解释。使用去甲基化、控制外源基因的拷贝数及结合位点、利用MAR序列、优化使用增强子、启动子等手段可以解除部分转基因沉默。     

Advances of Researches on the Mechanism of Transgene Silencing in Transgenic Plants

转基因沉默是导致外源基因不能在转化植株中正常表达的重要原因。在此,从转录水平和转录后水平两个方面,综述了转基因植物中外源基因沉默的机制。DNA甲基化是引起外源基因沉默的主要原因。人们目前用以下几种模型来解释转录后水平基因沉默的机制,如RNA阈值模型、异常RNA和异位配对模型及双链RNA模型。对外源基因沉默机制的探讨是顺利开展植物基因工程的迫切要求,也将促进植物功能基因组学研究的进一步深入。     

Construction of Tobacco Bax lnhibitor-1 ihpRNA Gene Silencing Vector and Transformation into Agrobacterium tumefaciens EHA105

The plasmid pGSA1285 was first modified by substituting its GUS sequence with the Chalcone synthase intron fragment from vector pFGC5941 to get the plant silencing expression vector that contained Kanamycin resistance site and was named as pGSA2285. Using PCR-based amplification, two different restriction sites at both ends of tobacco Bax inhibitor-1 (NtBI-1) gene were created, respectively, which made the construction of ihpRNA gene silencing vector more efficiently. Then, NtBI-1 genes were inserted into Multiple Cloning Site (MCS) of pGSA2285 respectively to form Bax inhibitor-1 ihpRNA gene silencing vector, named as pGSA4285, containing sense and anti-sense BI-1 sequence which was spliced by chalcone synthase intron. Combined PCR identification and enzyme restriction analyses, the results showed that Bax inhibitor-1 ihpRNA gene silencing vector had been constructed and transferred into Agrobacterium tumefaciens EHA105 successfully, which laid a foundation for the further study on the function of BI-1 in plant PCD regulation.     

烟草Bex inhibitor-1基因植物沉默表达载体的构建及对农杆菌的转化

试验首先对质粒pGSA1285进行改造,将pFGC5941质粒的查尔酮合酶的Intron片段取代pGSA1285的GUS片段,构建含有内含子并具有卡那抗性的pGSA2285植物沉默表达载体。同时设计引物、PCR扩增、在BI-1基因两端各加上两个酶切位点,将BI-1基因分别反向、正向插入改造后的质粒pGSA2285Intron片段两端的多克隆位点中,构建得到烟草BI-1基因沉默载体pGSA4285。此沉默质粒经PCR鉴定、限制性酶切分析以及回复动员试验证明已正确构建并成功转入农杆菌,为获得含有BI-1基因沉默烟草植株及其在植物程序性死亡中调控作用的研究奠定试验基础。     

两种方法研究不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰效应

目的:旨在观察不同茎部长度串联shRNA表达载体对EGFP基因的干扰作用。方法:采用体外培养的Vero细胞,选用不同茎部长度串联shRNA表达载体+EGFP表达载体+脂质体转染的方法,将构建好的干扰载体转染Vero细胞,然后使用实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。在小鼠腿部肌肉注射干扰质粒,实时荧光定量RT-PCR对其沉默效应进行定量分析。结果:转染Vero细胞时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的4.3%、3.0%和6.9%;小鼠腿部肌肉注射干扰质粒时,pGenesilR21、pGenesilR27和pGenesilR29荧光表达量仅为对照质粒pEGFP-C1的2.5%、1.3%和5.1%。结论:在细胞和个体水平,不同茎部串联干扰载体对目的基因的抑制效应均很明显(达到90%以上),比单一位点产生的沉默效应要强许多,不同茎部长度干扰效应彼此间差异不显著。     

酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体的构建

利用重叠延伸PCR获得酿酒酵母基因沉默组件SADH2,经酶切与酿酒酵母穿梭质粒pYES2.0连接,构建酿酒酵母ADH2基因沉默表达载体。经酶切及测序鉴定成功构建了ADH2基因沉默表达载体pSADH2。     

RNA干扰研究现状

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用双链RNA(dsRNA)诱导同源靶基因的mRNA特异性降解,从而导致转录后基因沉默的现象。其在抵抗病毒感染、抑制转座子活动、调控内源性基因表达等方面发挥重要作用。RNAi以其高特异性、高效性等显著优势将成为研究基因功能的全新手段。简要概括RNAi作用机制和siRNA技术的原理,同时也讨论了RNAi技术在其他领域,如在基因信号通路研究、高通量研究基因功能、基因治疗如肿瘤研究和疾病治疗等方面的应用。     

病毒诱导的精氨琥珀酸合成酶基因沉默对棉花氮代谢的影响

以棉花为研究对象,利用转录后基因沉默技术(VIGS)将棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)基因沉默,研究沉默后植物的氨基酸、多胺、一氧化氮(NO)等含氮化合物的代谢变化。结果表明:盐胁迫可以诱导棉花精氨琥珀酸合成酶(GhASS1)瞬时上调表达,GhASS1沉默严重影响氨基酸的合成,除天门冬氨酰(Ans)外,其他蛋白质组成型氨基酸质量分数显著降低,NO质量摩尔浓度和多胺(PAs)质量分数下降,棉花植株生长发育迟缓。GhASS1沉默对棉花精氨酸脱羧酶基因(GhADC)、棉花鸟氨酸脱羧酶基因(GhODC)表现出强烈的抑制作用,进而影响植物多胺的代谢和耐盐能力。高浓度盐环境下,沉默体系精氨酸(Arg)和NO质量摩尔浓度上升,GhARG1表达上调。GhASS1沉默对于植物是致命的,GhASS1是尿素循环和氨基酸代谢的关键环节,GhASS1沉默使GhARG1、GhADC和GhODC表达下调,严重影响整个氨基酸代谢,NO质量摩尔浓度,腐胺(Put)和精胺(Spm)质量分数显著降低,N代谢受阻,植株发育不良,生长迟滞,棉花中存在Arg-NO通路。