Taq DNA聚合酶的热纯化制备（摘要）

[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率。[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力。[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21（DE3）宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂。[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求。     

以冻融法快速纯化高活力基因工程Taq DNA聚合酶

用含有TaqDNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli DH5α菌株，IPTG诱导表达Taq DNA聚合酶，利用该酶的热稳定性，反复2次－70℃，75℃交替冻融以裂解细胞释放胞浆；以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化Taq DNA聚合酶的目的。PCR扩增反应和SDS－PAGE分析表明所制备的Tap DNA聚合酶的纯度，活力，敏感性，特异性均达到试验要求。该方法具有快速简便的优点。     

产物可直接进行“TA”克隆的高保真PCR法

[目的]介绍一种PCR产物直接进行"TA"克隆的高保真PCR法,减少高保真PCR产物"TA"克隆的中间步骤。[方法]Trizol法提取人肝癌细胞SMMC-7721总RNA,并将mRNA反转录成cDNA。以cDNA为模板,联合不同特性的Taq DNA聚合酶扩增PKC基因的蛋白编码区。PCR产物经纯化后进行"TA"克隆、细菌转化、筛选培养、质粒抽提、酶切鉴定和测序鉴定等。[结果]高保真DNA聚合酶扩增的PCR产物未发现DNA突变,但不能直接进行"TA"克隆。Taq DNA聚合酶扩增的产物可直接进行"TA"克隆,但其内部存在多个突变位点,保真性明显不足。联合使用高保真DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶(双酶联用)扩增的PCR产物可直接进行"TA"克隆,且DNA测序未发现突变。[结论]双酶联用PCR可以获得高保真PCR产物,并直接进行"TA"克隆。     

一种采用阴离子交换柱快速纯化Taq DNA聚合酶的方法

通过37℃恒温振荡培养含有Taq DNA聚合酶基因的E.coli菌株,并用IPTG诱导该基因表达获得TaqDNA聚合酶蛋白,利用40％硫酸铵沉淀该蛋白后溶解于storage buffer中.此法获得的Taq DNA聚合酶带负电荷,因此采用阴离子交换柱纯化蛋白.试验结果表明,此法与传统的透析方法相比能快速地去除生物小分子杂质,同时去除透析方法无法除去的杂蛋白;既能保证Taq DNA聚合酶的生物学活性,同时能缩短纯化时间、提高Taq DNA聚合酶的纯度.以土壤微生物DNA、水稻cDNA为模板进行PCR扩增并对扩增产物进行测序,结果显示纯化后的Taq DNA聚合酶具有较高的扩增效率和保真性.     

基于荧光检测的糜子Genic-SSR PCR体系优化

[目的]本研究基于Fragment Analyzer全自动毛细管电泳荧光检测系统,以期建立一个最优的糜子GenicSSR分子标记PCR反应体系。[方法]试验采用L16(44)正交设计,设计了Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和引物的不同浓度组合,并用Pragment Analyzer全自动毛细管电泳荧光检测系统检测PCR产物。[结果]Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物浓度对PCR反应效应为:Mg2+引物dNTPsTaq DNA聚合酶。通过正交实验设计确立了糜子Genic-SSR荧光PCR检测体系的最佳反应组分:20μL的反应体系中包含0.2 mmol·L-1的dNTPs,0.2μmol·L-1引物,1.5mmol·L-1的Mg2+和0.5U的Taq DNA聚合酶。[结论]本研究建立了糜子的Genic-SSR分子标记的最佳荧光PCR反应体系,为糜子种质资源遗传多样性分析中分子标记开发、验证和辅助育种奠定了基础。     

重组Taq DNA聚合酶的表达和纯化鉴定

【目的】表达、纯化Taq DNA聚合酶,并检测其扩增性能。【方法】活化含Taq DNA聚合酶基因的菌株JM109,IPTG诱导表达。目的蛋白利用AKTA蛋白纯化系统,依次过Affi-Gel Blue Sepharose,Heparin Sepharose Fast Flow,Q-Sepha-rose Fast Flow,经SDS-PAGE分析,以国外进口Taq酶为标准,采用对比法初略测定酶活性,验证产品质量。【结果】制备的Taq DNA聚合酶具有扩增效率高、纯度高、特异性强、无核酸酶污染、活性稳定等优点。【结论】成功表达纯化Taq DNA聚合酶,其扩增性能达到甚至超过国外同类产品。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

正交设计构建陕北山杏ISSR反应体系

[目的]构建陕北山杏ISSR-PCR反应体系。[方法]以陕北山杏为试材,采用CTAB法提取其幼叶基因组DNA,利用正交设计L9(34)对山杏ISSR-PCR反应体系的4个因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶)在3个水平上进行试验,最后应用SPSS统计软件对PCR结果进行分析。[结果]试验表明,各因素的不同水平对PCR反应体系结果都有显著影响,其中Taq DNA聚合酶用量影响最显著;建立了适合陕北山杏ISSR-PCR的最佳反应体系(20μl):Taq DNA聚合酶1.0 U、MgCl21.0 mmol/L、dNTPs 0.15 mmol/L、引物0.30μmol/L;对最佳反应体系进行验证,结果显示该体系稳定性好,操作性强。[结论]该研究为陕北山杏遗传多样性分析及种质资源研究等奠定了基础。     

吴茱萸ISSR-PCR反应体系优化

[目的]建立吴茱萸ISSR-PCR最佳反应体系。[方法]采用改良的CTAB法提取吴茱萸基因组DNA,研究模板DNA、dNTPs、Mg^2＋、引物（U834）、Taq DNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR扩增结果的影响。[结果]20μl反应体系中含2μl 10×PCR buffer,0.15 mmol/LdNTPs,1.6 mmol/L Mg^2＋,0.4 mmol/L引物,20 ng模板DNA,1.2 U Taq DNA聚合酶。[结论]为研究吴茱萸种质资源遗传多样性和分子鉴定奠定了技术基础。     

真藓科植物ISSR-PCR反应体系的优化及ISSR指纹图谱的初步构建

[目的]试图通过ISSR指纹图谱的构建,为真藓科（Bryacae）植物的种类鉴定提供分子分析数据。[方法]为获得标准试验程序,首先利用正交试验设计的方法对真藓科植物的ISSR-PCR反应的5因素（Mg2＋、dNTPs、引物、DNA模板、Taq DNA聚合酶）4水平进行试验。[结果]最适扩增条件是：在20μl PCR反应体系中,5 ng模板DNA,0.2μmol/L引物,2.25 mmol/L MgCl2,0.6 U Taq DNA聚合酶,进行PCR扩增,共扩增出86条带,多态性带为86条,多态率达100%。根据扩增结果进行NJ聚类分析,得到的支序图呈星状。[结论]ISSR指纹能够在种级分类水平提供适度的多态性,利用引物UBC808、811以及826构建的ISSR指纹图谱能够区分所有供试植物,为利用ISSR指纹技术解决真藓科植物种级水平分类关系问题时提供了分子辅助证据的可行性。     

麻栗坡兜兰ISSR引物筛选及反应体系的优化

[目的]对麻栗坡兜兰ISSR引物进行筛选,并建立一个稳定性高、重现性好、适合麻栗坡兜兰ISSR反应体系。[方法]以麻栗坡兜兰DNA为模板,分别对Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、DNA等PCR反应成分进行优化,并用优化的体系对25条兰科中报道的ISSR引物进行筛选。[结果]确立了麻栗坡兜兰最适ISSR-PCR反应体系:在25μl反应体系中,Mg2+2 mmol/L、引物0.4 mmol/L、dNTP 0.20 mmol/L、DNA 1.5μl、Taq酶1.4 U。利用该体系,共筛选得到10条ISSR引物用于麻栗坡兜兰分析,并对21份麻栗坡兜兰材料进行扩增,获得了较好的扩增效果。[结论]该体系稳定可靠,为今后ISSR标记在兜兰属植物的种质鉴定、遗传多样性等方面的广泛应用奠定了重要基础。     

黑麦特异性PCR反应体系的建立（摘要）

[目的]建立黑麦特异性PCR反应优化体系。[方法]以普通小麦＂中国春＂、S165、黑麦、八倍体小黑麦、六倍体小黑麦为试验材料,研究了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2＋浓度、TaqDNA聚合酶用量及退火温度对黑麦特异性PCR反应体系的影响。[结果]采用改良的CTABDNA微量提取法可以得到高质量的基因组DNA,满足PCR反应模板的要求,黑麦特异PCR扩增反应体系为：在25μl反应体系中,10×缓冲液,1.5mmol/LMgCl2,200μmol/LdNTP,40ng引物,40～60ng模板DNA,1UTaq酶。[结论]建立了适宜的黑麦特异PCR扩增反应体系,可为小麦背景下黑麦外源种质的检测奠定基础。     

松江鲈鱼ISSR-PCR反应体系的建立及优化研究(英文)

[Objective] The aim of this study is to establish and optimize the ISSR-PCR system in roughskin sculpin(Trachidermus fasciatus Heckel).[Method] By using the primer of ISSR-63,the concentrations of Taq DNA polymerase,Mg2+,dNTPs and primer were optimized by orthogonal design for establishing the suitable ISSR-PCR system in roughskin sculpin;moreover,the suitable anneal temperature was yielded from gradient PCR on temperature.[Result]The optimized ISSR-PCR system(20 μl reaction volume)in roughskin sculpin was proved to be:2.5 mmol/L Mg2+,250 μmol/L dNTPs,0.25 μmol/L primer,1 U Taq DNA polymerase,30 ng DNA template and 1×PCR buffer;and suitable anneal temperature was determined to be 50.8 ℃.The established system was further confirmed by using 24 wild roughskin sculpin samples.[Conclusion]The results lay a foundation for the analysis of genetic diversity and germplasm resources of roughskin sculpin.     

SELEX技术中ssDNA文库PCR扩增条件的优化(英文)

[目的]对SELEX技术中ssDNA文库的PCR扩增条件进行优化。[方法]采用L16(45)正交试验设计在4个水平上对影响单链随机DNA文库PCR反应体系的Mg2+浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶含量、引物浓度和随机单链DNA文库量5个重要因素进行了优化,同时对PCR反应的退火温度和循环次数进行了优化,确立最优反应体系和扩增程序。[结果]20μlPCR反应体系及反应程序中各因素优化组合为:10×Buffer2.0μl,随机ssDNA文库0.5ng,Mg2+2.5mmol/L,dNTP Mixture0.25mmol/L,上下游引物各0.6μmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U;退火温度为68℃,最佳循环数为12。此反应系统下,随机ssDNA文库PCR扩增谱带清晰、稳定、特异性高。[结论]为SELEX技术中筛选到特异性更强的适配子奠定了基础。     

一种快速低廉的PCR探针标记方法

【研究目的】探针标记技术是分子生物学和基因工程研究中常用实验技术,需要发展高效、快速、低成本、安全、简捷的DNA探针标记方法;【方法】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,电泳和Southern杂交检测探针标记结果;【结果】电泳检测发现标记产物在电泳时相对非标记的对照表现明显滞后,表明探针标记成功;电泳条带清晰明亮,表明探针标记效率高;Southern杂交条带清晰,说明该方法标记的探针可用于Southern等分子杂交实验;【结论】利用普通的Taq酶进行PCR探针标记,是一种低成本、高效、快速的DNA探针标记方法。     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（4^5）对小麦SRAP．PCR反应体系中的5因素（细聚合酶、Mg^2、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系的影响为：Mg^2〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP—PCR体系为：在20山反应体系中,包括10×PCRBuffer2．0山、Mg^2 2．0mmol／L、砌聚合酶2．0U、dNTPs0．2mmol／L、模板DNA40ng、引物0．6μmolVL。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。