普通荞麦染色体的原位PCR技术研究

[目的]探索一种适合荞麦的简单易行的染色体原位PCR技术。[方法]采用16S套式引物、4.5S套式引物与psbA引物,以栽培甜荞为材料,进行了染色体原位PCR、原位套式PCR与多次原位PCR试验。[结果]高温干燥可以起到与包埋类似的作用;染色体的原位套式PCR效果比原位PCR明显;多次原位PCR次数为5～6效果较佳。16S引物和4.5S引物均显示了4对信号,但位置不同;而psbA引物是单拷贝的,仅显示出1对信号。根据这些信号得位置差异可以区分普通荞麦的5对染色体。[结论]所使用的荞麦染色体原位PCR技术简单易行。     

柑桔黄龙病亚洲种病原（Candidatus Liberobacter asiaticus）16S rDNA的PCR—SSCP分析

应用PCR—SSCP技术对我国柑桔主要产区、泰国和法国留尼湾等地收集到的柑桔黄龙病亚洲种病原（Candidatus Liberobacter asiaticus）16S rDNA进行了分析。PCR结果表明,不同的地区的柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA在长度上没有明显区别。进一步的SSCP结果显示,不同地区柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA序列在组成上也没有差异。显示来自不同地区、不同寄主品种的柑桔黄龙病亚洲种种内没有存在明显差异。     

甘蔗宿根矮化病PCR检测技术优化分析

[目的]在PCR的基本程序上,以甘蔗宿根矮化病菌Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区特异性引物,优化PCR反应条件,以建立稳定、快速、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病PCR检测技术.[方法]以Lxx基因组DNA为模板,采用TaKaRa的Ex Taq Polymerase和2×GCBuffer Ⅱ,调整退火温度和引物浓度等主要因子,优化PCR反应体系;稀释Lxx基因组DNA模板的浓度,检测优化PCR的灵敏度;用优化的PCR对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行RSD测定.[结果]优化的PCR得到清晰特异的条带为Lxx 16S~23S rDNA内部转录间隔区序列;能从稀释1000倍的Lxx基因组DNA( 15.9 pg/μL)中检测到Lxx,而常规的PCR只能从稀释10倍的Lxx基因组DNA( 159 pg/μL)中检测到Lxx,且出现假阴性,不稳定.对田间生长的甘蔗品种GT11叶片总DNA进行PCR检测,结果用优化后的PCR检测RSD感染率为66.7%,而常规的PCR检测RSD感染率为0.[结论]优化的PCR体系为:2xGC Buffer Ⅱ12.5 μL,Ex Taq DNA酶(5 U/μL)0.2 μL;dNTP(2.5 mmol/L)1.5 μL;Lxx1(10 μmol/L)1.0μL,Lxx2(10μmol/L)1.0 μL,DNA模板1.0 μL,用ddH2O双蒸水补足至25.0μLcPCR反应程序为:95℃预变性10 min,94℃ 15s,57℃ 15 s,72℃ 30 s,40个循环;72℃延伸10 min.优化的PCR比常规PCR的灵敏度高、结果稳定、检测效率高,更适合于田间大批量样品快速检测.     

柑桔黄龙病亚洲种病原(Candidatus Liberobacter asiaticus)16S rDNA 的PCR-SSCP分析

应用PCR—SSCP技术对我国柑桔主要产区、泰国和法国留尼湾等地收集到的柑桔黄龙病亚洲种病原（Candidatus Liberobacter asiaticus）16S rDNA进行了分析。PCR结果表明,不同的地区的柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA在长度上没有明显区别。进一步的SSCP结果显示,不同地区柑桔黄龙病亚洲种16S rDNA序列在组成上也没有差异。显示来自不同地区、不同寄主品种的柑桔黄龙病亚洲种种内没有存在明显差异。     

甘蓝2号染色体的高分辨率5S rDNA荧光原位杂交

 【目的】羽衣甘蓝5S rDNA 的染色体定位和拷贝数分析,为进一步利用FISH进行2号染色体基因定位和细胞遗传图谱构建奠定基础。【方法】以羽衣甘蓝为材料,采用荧光原位杂交技术将DIG标记的5S rDNA探针定位于不同分辨率的绒毡层细胞中期染色体、粗线期染色体以及伸长DNA纤维上。【结果】在中期染色体和粗线期染色体上,都同时获得3个杂交信号位点（a、b、c）,且位于2号染色体的长臂近着丝粒区域,其信号强度为b＞a＞c;而在伸长DNA纤维上,出现了3种不同长度的念珠状长链（a、b、c）, 其物理大小分别为257、359和134 kb,这3种长链分别与3个信号位点形成一一对应关系。【结论】在羽衣甘蓝2号染色体上存在3个串联重复位点,粗略估算出3个5S rDNA位点的拷贝数分别为510、712和266。     

利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究

为了建立一种快速、特异的禽源性成分检测方法,以线粒体16S r RNA基因序列为靶位点设计鸡、鸽、鹌鹑特异性引物,以常见畜禽肉(包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等)DNA为模板,进行PCR扩增和特异性检测。结果表明,筛选的引物能够有效地对动物源性成分进行检测,方便简洁,可快速鉴别畜禽肉食品中含有的鸡源性、鸽源性、鹌鹑源性成分。     

利用PCR技术鉴别畜禽肉中鸭源性成分研究

[目的]建立一种快速准确的鸭源性成分检测方法.[方法]分别以线粒体16S rRNA基因和COⅠ基因序列为靶位点设计鸭特异性引物,以常见畜禽肉(羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉)DNA为模板,进行PCR扩增,检测引物的特异性和灵敏度.[结果]筛选的引物能够有效地对鸭源性成分进行检测,方便简洁,灵敏度较高.[结论]该方法能够快速有效地鉴别畜禽肉中鸭源性成分.     

应用DGGE技术分析自然免耕土与普通耕作土细菌群落的多样性

为探明免耕土壤与普通耕作土壤环境中细菌群落的多样性,获取相关优势菌落信息,该研究利用宏基因组学方法获得免耕土和普通耕作土样品总DNA,利用PCR获得16SrDNAV3片段,并进行变性梯度凝胶电泳(Denaturation gradient gel electrophoresis),通过微生物种群丰富度比较两样品中群落的丰富性,同时选取相关DNA条带进行克隆、测序和生物信息学分析.结果显示:免耕土壤中细菌群落多样性更加丰富;两类型土壤样品间细菌群落组成具有显著差异,证明耕作制度影响了土壤细菌群落结构.BLAST分析与系统发生分析结果表明,免耕土壤中特异存在的细菌群落与具有生物固氮、降解甲苯和倍硫磷等特性的细菌序列相似性较高或进化关系较近,推测其在免耕土壤肥力、有毒物质降解及有机质转变等过程中起作用.     

食堂越冬家蝇体表携带细菌的初步研究

采用稀释涂布平板法和构建16S rDNA文库法,对越冬家蝇体表携带的细菌数量和种类进行了分析。通过培养计数发现越冬家蝇（Musca domestica）体表携带细菌数量较少,每头越冬家蝇体表携带的细菌数量居于5×104~1.2×105之间。对随机挑选的987个16S rDNA文库克隆进行了测序,通过16S rDNA序列比对分析发现：88.6%的测序克隆为细菌,共检测出32种细菌,其中大肠埃希氏菌（Escherichia coil）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）,肠道沙门氏菌（Sal monellaenterica）4种人畜肠道菌分别占检出率的13.6%、1.9%、3.3%和1.5%,说明越冬家蝇体表携带细菌主要来源于人畜粪便;同时还检出结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）、口腔纤毛菌（Leptotrichia buccalis）、支气管炎博德特菌（Borde-tella bronchiseptica）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和痤疮丙酸杆菌（Propionibacteriumacnes）等致病菌和条件致病菌。     

用于PCR扩增的细菌DNA提取方法比较

以14个属的革兰阴性菌和阳性菌为研究对象,采用16S rRNA基因PCR扩增对4种细菌DNA提取法进行了比较.结果表明,对细菌DNA的提取效果排序,依次为冻融法、煮沸法、碱解法、ROSE法.冻融法效果最好,具有成本低、省时省力、无污染等优点,但仍存在少数革兰阳性菌DNA提取失败的现象.因此,在菌株较多的情况下可先采用冻融法提取细菌DNA,对少数提取失败的菌株,弃冻融法得到的上清液,再以SDS法、CTAB法或DNA试剂盒的提取进行补充.采用该操作流程既能节省成本和时间,又减少了提取过程中有机废弃物的产生.     

荞麦茎叶中总黄酮的提取工艺研究

[目的]研究甜荞和苦荞茎叶中总黄酮的提取工艺。[方法]以总黄酮得率为指标,通过正交试验优选出最佳提取条件。[结果]最佳提取工艺以75%乙醇为溶剂,1∶25的料液比在65℃振荡提取2 h。在该优化条件下,甜荞、苦荞茎叶中总黄酮得率分别为5.65%、6.54%。[结论]该方法简单、快捷,便于推广和普及,是提取荞麦茎叶中总黄酮的有效方法。     

甜荞子粒总黄酮提取工艺的优化

为了充分利用荞麦(Fagopyrum esculentum)资源,以内蒙古甜荞子粒为研究对象,利用乙醇提取法提取子粒中总黄酮,并对其工艺进行优化.最终得出荞麦子粒总黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数65％,水浴时间80 min,水浴温度60℃,料液比1:20(m/V,g:mL).     

用ISSR标记分析甜荞栽培品种的遗传多样性

[目的]研究用ISSR标记分析甜荞栽培品种的遗传多样性。[方法]采用ISSR分子标记对来自11个省的90份甜荞种质的遗传多样性进行了分析。[结果]19条ISSR引物共扩增出508条条带,平均26.7条;其中多态性条带462条,平均24.3条,多态性带的百分率为90.1%。Nei’s遗传相似系数在0.67~0.95。UPGMA聚类分析显示,聚类结果与地理来源有较强的一致性,来自辽宁、内蒙古、陕西、四川、甘肃等省的甜荞都是按来源各自聚为一类,但是发现了几个特殊的类型,即来自河北的甜荞E、安徽的82F以及辽宁的辽荞37号均单独聚为一类。不同地区材料之间的多态性信息指数（PIC）差异较大,其中,辽宁的最高,为0.842,内蒙古的最低,为0.633。[结论]采用ISSR分析甜荞遗传多样性,甜荞表现出丰富的多态性,表明可以用ISSR标记对甜荞进行分子水平的鉴定和遗传多样性分析。     

荞麦蛋白质组分中氨基酸和矿物质研究

在对 4个荞麦品种籽粒的蛋白质组分、各蛋白质组分中氨基酸组成及矿物质含量进行分析的基础上 ,探讨了蛋白质组分与氨基酸含量及蛋白质组分与矿物质含量间的分配关系 ,探讨了氨基酸和矿物质在荞麦籽粒蛋白质组分中的分布及比例 ,以及荞麦籽粒的营养价值。1　材料与方法1 .1　材料甜荞日本春播荞麦和榆荞 1号 ,苦荞日本夏播荞麦和榆荞 6-2 1为 1 997年收获的样品 ,分别由陕西省吴旗县和陕西省榆林农校提供。样品除杂后 ,于 38℃条件下风干 4 8h。样品用实验磨粉机粉碎 ,过 Φ0 .3mm圆孔筛 ,取筛下物作为分析样本。1.2方法采用蛋白质组分的连…     

16SrDNA对四种常见细菌中的鉴定与应用

本实验利用16SrDNA序列分析技术,对来自犊牛腹泻粪便中的四株菌（A菌,B菌,C菌,D菌）进行菌种鉴定。使用16SrDNA通用引物,通过PCR扩增分别得到1500bp,与GenBank中序列进行比对。结果表明：A菌与肠杆菌属、B菌与短小芽孢杆菌、C菌与大肠杆菌、D菌与变形杆菌的同源性最高,相似率均达到了99％,初步确定A菌为肠杆菌属、B菌为短小芽孢杆菌、C菌为大肠杆菌、D菌为变形杆菌。本试验的目的是为16SrDNA在临床细菌的鉴定提供客观理论依据。     

广东茄科雷尔氏菌16S rDNA序列分析

应用PCR方法,获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香共12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S rDNA.序列测定及比较结果表明,21个广东茄科雷尔氏菌菌株16S rDNA近全长序列均为1 528 bp,序列间同源率99.2%～100%;各菌株的16S rDNA序列间只有1～12个不等的碱基差异,其中20个菌株的458～460位及474位的碱基是ACT和T,而菌株HZ-1则是TTC和A,说明广东茄科雷尔氏菌的16S rDNA序列十分保守.系统进化分析结果显示,仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌2a亚组中,其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中.     

玉米叶面微生物DNA提取方法及PCR引物的筛选

传统的微生物培养方法在反映叶面微生态信息上具有局限性,因此逐渐被分子生态学所代替,而获得高质量、大片段、无偏好的总DNA是研究叶面环境微生物的基础。本文采用改进的Sambrook法、CTAB法、改良的化学法以及试剂盒法对玉米生长初期、中期、末期的叶面微生物总DNA进行提取,并对4种方法提取的DNA片段的大小和产量进行综合评价。将得到的DNA用引物357/518以及984/1387对细菌16S rDNA进行扩增;用5种常见引物NS1/fung、ITS1-F/ITS2、NS1/AM1、EF4/fung5、SSU-0817/SSU-1196对真菌18SrDNA进行扩增。结果表明:4种方法提取的DNA片段均适用于PCR,但DNA的得率和纯度有一定差别,其中以试剂盒提取效果最好。PCR结果显示,除化学法外,其他3种方法提取的DNA均能够获得目的条带;并通过比较得出引物984/1387对16S rDNA以及ITS1-F/ITS2对18S rDNA扩增效果较好且扩增量最大。     

种植密度对荞麦生理指标、农艺性状及产量的影响

以荞麦(Fagopyrum esculentum Moench.)宁荞1号为试验材料,研究了不同种植密度对荞麦生理指标、农艺性状及产量的影响。结果表明,在干旱条件下,高密度加速了荞麦叶片叶绿素的分解和可溶性蛋白质含量的下降,降低了抗氧化酶SOD、POD、CAT的活性及加速了MDA含量的积累。在干旱条件下,低密度处理有利于荞麦单株粒数、单株粒重、千粒重及产量的增加。     

瘤胃甲烷生成菌PCR反应条件的优化

[目的]优化适合于瘤胃甲烷生成菌的PCR反应体系。[方法]以1．5周岁健康的藏系绵羯羊瘤胃内容物总DNA为模板,用特异性引物对甲烷生成菌16SrDNA保守序列进行PCR扩增,并通过改变PCR反应体系中的各参数,优化其PCR反应体系中的相关参数。[结果]PCR最优程序为：94℃预变性3min;94℃变性45s,51℃退火458,72℃延伸90s,35个循环;72℃后延伸7min。优化后的PCR反应体系为：5．00山缓冲液,4．00μl d-NTP,2．00μl引物（前引物和后引物各1．00μl）,4．00μl MgCl2,0．25μl TaqDNA聚合酶和1．00μl 1：100倍稀释的DNA模板,然后加水补足25．00μl。[结论]该研究为瘤胃甲烷生成菌功能的研究奠定了基础。