豆豉纤溶酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

[目的]为豆豉纤溶酶的进一步研究与应用奠定基础。[方法]以从芽孢杆菌中提取的总DNA为模板,根据GenBank的豆豉纤溶酶基因(AY720895.2)DNA序列设计1对引物,克隆豆豉纤溶酶基因并进行序列测定。构建毕赤酵母表达载体pL3,在毕赤酵母中表达豆豉纤溶酶基因。[结果]经PCR扩增可获得约1.1 kb的DNA片段。序列分析表明所克隆DNA片段包含1个1089 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸。该克隆基因与所发表的豆豉纤溶酶基因序列的核苷酸序列同源性为98%,而氨基酸序列同源性达100%。[结论]所克隆的豆豉溶纤酶基因在毕赤酵母中成功表达,且表达产物具有正常的生物学活性。     

豆豉纤溶酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据已发表的豆豉纤溶酶基因DNA序列(GeneBank AY720895.2),设计并合成了一对引物,应用PCR技术以筛选的来自豆豉的产纤溶酶的芽孢杆菌的总DNA为模板,扩增出了豆豉纤溶酶基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,进行了序列测定,测序结果经Genetool序列分析表明该基因长1 089 bp,编码363个氨基酸,与已发表Brevibacillus laterosporus豆豉纤溶酶基因序列在核苷酸水平上与所发表的序列有98%的同源性;在氨基酸水平上与已发表的芽孢杆菌豆豉纤溶酶同源性为100%。并将该基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b上,在大肠杆菌中实现了高效表达。     

豆豉纤溶酶研究进展

豆豉纤溶酶是从中国传统风味食品豆豉中分离得到的一种纤维蛋白酶,具有良好的溶解血栓作用。综述了豆豉纤溶酶产生菌的菌种,豆豉纤溶酶的理化性质、溶栓作用以及分子生物学研究现状。由于豆豉纤溶酶与传统的溶栓剂相比,具有活性高,安全无毒,分子量小,可以通过消化直接吸收等优点,因此具有广阔的应用前景。     

豆豉纤溶酶基因在枯草杆菌中表达的研究进展

文中介绍了豆豉纤溶酶的分子生物学特性及其基因在宿主表达菌——枯草杆菌中表达的研究进展。     

豆豉纤溶酶高产突变株的选育

[目的]从豆豉中筛选出高产纤溶酶的菌株,并通过平板筛选得到高产突变株。[方法]从6种不同豆豉样品中,筛选得到具有较高纤溶酶活性的菌株,采用物理化学诱变方法进行复合诱变,再利用纤维蛋白平板对诱变后菌株进行筛选。[结果]得到1株高纤溶酶活力菌株,命名为DC-YC41,酶活达到742 IU/ml。[结论]初步判断,得到的这株高纤溶酶活力菌株为枯草芽孢杆菌。     

豆豉纤溶酶产酶菌的筛选及菌种保藏

[目的]从豆豉产品中筛选分离活性较高的豆豉纤溶酶产酶菌,并对菌种进行保藏。[方法]用自制的猪血粉为底物配制筛选培养基进行豆豉纤溶酶产酶菌的筛选,然后根据水解圈的大小筛选活性高的产酶菌株,最后将其保藏于LB培养基中。[结果]成功从湖南、广东、江西等地产的豆豉中筛选到一株溶栓活性相对较高的产酶菌。[结论]该研究为新型溶栓药物的开发奠定了基础。     

W-15菌株产生的纤溶酶蛋白的提取与纯化

为从微生物中获取溶栓药物,从土壤、豆豉中获得产纤溶酶活性高的1株菌株,命名为W-15。经检测,发酵上清液中纤溶活性的蛋白酶分子质量约为36 kDa,酶的比活为1 571 UK/mg。     

豆豉纤溶酶产生菌的筛选

以新鲜的猪血制取的猪血粉作为培养主要基质进行产纤溶酶菌株的筛选,经平板法初筛,从3个不同来源的豆豉样品中筛选出10株较高纤溶活性的菌株.通过摇瓶复筛确定1个产酶活性最高的菌株HN3,液体发酵确定其产酶最适温度、时间分别为30 ℃、96 h.     

中介蝮蛇毒纤溶酶基因克隆及生物信息学分析

克隆中介蝮蛇(Gloydius intermedius)纤维溶解酶(Fibrinolytic enzyme,FLE)基因,分析其基因序列并对该基因的功能进行分析.从中介蝮蛇毒腺细胞中提取总RNA,通过RT-PCR法扩增纤溶酶基因,与pMD18-T载体连接进行TA克隆,再进行序列的测定并且对该序列进行分析.扩增得到完整开放读码框在内的长为777 bp的纤溶酶基因序列.成功克隆了编码中介蝮蛇纤溶酶的基因序列,推导其编码的氨基酸序列.开放读码框编码258个氨基酸,含有大量疏水氨基酸.其中,前1～19位氨基酸编码信号肽;根据同源性推测,以His65、Asp110和Ser204组成纤溶酶的活性中心并高度保守;序列内合12个Cys.两两配对结合成的6个二硫键对纤溶酶的高级构型和稳定性至关重要.成功克隆中介蝮蛇毒纤溶酶基因为进一步研究该基因的遗传特征以及为该酶在原核及真核生物中的表达研究提供依据.     

蚯蚓纤溶酶的研究进展

蚯蚓纤溶酶是近年发现的一种新型溶栓物质,该酶具有纤溶活性和溶栓活性,故其研究受到了极大的关注。文章概述了蚯蚓纤溶酶结构特点、药用价值、酶学活性、基因获取与表达、开发利用等方面近10年以来的研究进展。     

微生物发酵制备纤溶因子的研究进展

血栓性疾病是目前危害人类健康的第一大健康杀手,微生物发酵制备纤溶因子安全性高,是国内外筛选特异性强的溶栓剂常用方法之一。综述了纤溶茵（或纤溶酶）来源、纤溶酶制备和溶栓发酵液的其他生物活性,并对微生物发酵制备纤溶因子的未来发展方向进行了展望。     

Cloning and Expression of One Fibrinolytic Enzyme from Bacillus sp. zlw-2

The gene encoding fibrinolytic enzyme from Bacillus sp. zlw-2 was cloned and sequenced （accession no. EU734749）, which was 1146 bp, encoded 381 amino acids and had 99% homology with Nattokinase YF308 and NAT. The genes encoding pre-pro-fibrinolytic enzyme （including signal peptide, propeptide, and mature peptide） and fibrinolytic enzyme （including mature peptide） were cloned into pET28a vector respectively and then transformed into Escherichia coli BL21 （DE3）. The recombinant ofpre-pro-fibrinolytic enzyme showed enzyme activity of 183 U mL^-1, while no detectable enzyme activity could be found from the recombinant of the mature peptide.     

产纤溶酶菌株的分离筛选

以脱脂奶粉作为初筛底物,纤维蛋白作为复筛底物,透明圈作为筛选标记,从肉联厂,污水沟等地筛选出产纤溶酶的菌株40株,从中筛选出产酶活力最高的2号菌株,将其编号为ZLW-2,并采用改进的紫外分光光度法测酶活,提高了酶活测定的精确性,对提高纤溶酶产生菌的筛选效率有重要意义。菌株ZLW-2的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌体大量生长以后酶活力才开始增加。     

纳豆激酶植物高效表达载体的构建

纳豆激酶来源于日本的传统食品—纳豆,是一种具有强烈溶栓作用的蛋白激酶,将编码纳豆激酶的基因克隆到含C aM V 35S控制下的双元表达载体pCAM B IA 1300中,PCR结果表明,纳豆激酶基因正向插入到载体中,再通过冻融法将其导入根癌农杆菌LBA 4404中,从而成功地构建了能在植物中高效表达的植物载体,为用植物作为生物反应器来获取纳豆激酶蛋白提供了一条新途径。     

溶栓纳豆菌的筛选鉴定及其发酵特性研究

为开发具有特定生理活性的新型纳豆保健品，从酱豆，豆豉及纳豆中分离和筛选到5株有明显纤溶活性的芽孢杆菌，其中NK－5菌活性最高，被用作溶栓纳豆生产菌，根据形态，生理生化特征以及DNA中G＋G含量，鉴定NK－5菌株为枯草杆菌（Bacillus subtilis)，该菌株的重要特点是产生强力纤溶酶和大量胞外粘质，后经鉴定为γ－多聚谷氨酸，用NK－5菌株试制的纳豆既有日本纳豆的感官特征和营养组成，又有很高的纤溶活性，庐酶在4度下贮存两个月后仍能保持70％酶活力。     

纳豆激酶研究进展

纳豆激酶是由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)分泌表达的碱性丝氨酸蛋白酶,具有极强的纤维蛋白溶解活性。研究表明,纳豆激酶纤溶活性强、副作用小,可用于开发溶栓药物。介绍了纳豆激酶的溶栓机理,就纳豆激酶的功效、生产菌种选育、发酵条件的优化、酶活性位点及定向进化等方面进行综述。