大豆再生植株抗草铵膦的筛选方法研究

为解决农杆菌介导的大豆子叶节转化试验中草铵膦筛选所得转基因后代假阳性高的问题,采用浸种法、根吸法、叶片涂抹法、叶片喷洒法4种筛选方法和多种筛选浓度对大豆再生植株及其后代抗性进行筛选.结果采用1∶ 200 草铵膦浓度的叶片喷洒法效果最佳.叶片喷洒法筛选6802株转化植株,获得了9株抗性植株,其后代的分子检测表明均为阳性植株.因此,采用叶片喷洒法对大豆抗草铵膦植株进行筛选的方法简便可行.     

高产大豆新品系哈交5337和哈交5489再生条件的优化

为了拓宽大豆受体材料基因型,提高转基因大豆的应用价值,对两个综合性状较好的新品系大豆哈交5337和哈交5489进行子叶节器官发生途径再生条件的优化研究.在芽诱导培养基中添加不同浓度6-BA和IBA,采用正交法进行分析,取含6-BA(G1)萌发培养基中的大豆子叶节与不含6-BA(C2)萌发培养基中的大豆子叶节做平行对照,结果表明哈交5337最适的萌发培养基与芽诱导培养基的组合为G1S7(萌发培养基中不添加6-BA,芽诱导培养基中添加1.7 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1IBA)和G2S4(萌发培养基中添加1.0 mg·L-1的6-BA,芽诱导培养基中添加1.1mg·L-16.BA和0.1 mg·L-1IBA);哈交5489最适的萌发培养基与芽诱导培养基的组合为G1s4(萌发培养基中不添加6-BA,芽诱导培养基中添加1.1 mg·L-16.BA和0.1 mg-L-1IBA)和C2S4(萌发培养基中添加1.0 mg·L-1的6-BA,芽诱导培养基中添加1.1 nag·L-16-BA和0.1 mg·L-1IBA);同时确定两个品系大豆在丛生芽分化阶段采用延迟筛选方法,草铵膦筛选浓度为3.5 mg·L-1.     

大豆新品系黑农56子叶节再生体系的优化

为获得高效的大豆再生体系,选用大豆新品系黑农56子叶节进行了组织培养的研究,确定黑农56最适的萌发培养基与芽诱导培养基激素浓度.即萌发培养基为不含6-BA的MS培养基;芽诱导培养基添加6-BA和IBA的浓度分别为2.0 mg·L-1,0.2 mg·L-1的B5培养基.并确定黑农56的草铵膦选择压力为4 mg·L-1.     

大豆子叶节遗传转化体系优化及抗逆基因AtNHX5的转化研究

以河北省优良大豆品种冀豆15、五星2号和NF-58的子叶节为受体材料,利用农杆菌介导法进行遗传转化,探讨了影响农杆菌侵染后子叶节不定芽诱导的因素。结果表明:以萌发6 d、4℃处理24 h的子叶节为外植体,农杆菌侵染后经超声波处理30 s、共培养基中添加20 mg·L-1硝酸银,能够提高子叶节丛生芽诱导率,转化植株经草铵膦筛选以及PCR检测,T0代转化率达0.97%。利用该体系对大豆品种五星2号进行At NHX5基因的遗传转化,获得3株T0代RT-PCR检测阳性植株,且2-1号T1代阳性植株检测具有一定耐盐性,初步证明获得了转At NHX5基因的大豆新材料。     

未成熟种子子叶节转化体系优化及转EPSPS/GAT基因大豆新材料创制

以丛生芽率为指标,将农杆菌介导的大豆未成熟种子子叶节转化与成熟种子转化体系进行比较,明确了诱导过程中草甘膦筛选浓度、未成熟种子生理状态,改进大豆外植体的获得方式并减少了组培环节,建立了未成熟种子子叶节转化体系。利用Jack黄熟后期的种子作为受体材料,在15 mg·L-1的草甘膦筛选浓度下获得了9株PCR检测阳性植株并且生长正常可育,T0代经测序及Southern Blot分析,进一步证明外源基因已整合进大豆基因组中,其中2个株系的T1代植株经PCR检测符合3∶1的分离比,且表型鉴定筛选出抗性转基因植株,为抗草甘膦转基因大豆育种提供了新材料。     

农杆菌介导法将Bt(cryⅠA)基因导入大豆的研究

构建含有Bt(cry Ⅰ A)基因的植物表达载体pCAMBIA3300-Bt,以大豆子叶节为受体,通过农杆菌介导法将Bt基因导人大豆品种黑农37中,获得转基因植株.并进行人豆的再生和遗传转化系统优化的研究,以获得较高的转化率.结果表明:在6-BA浓度为1.7 mg·L-1时,丛生芽分化率最高,确定该品种大豆在从生芽分化阶段的草铵膦筛选浓度为3.5 mg·L-1获得转化质粒pCAMBIA3300-Bt的转基因植株,其中T1代PCR阳性植株19株.采用real-time PCR的方法对T1代抗性植株进行Bt基因的转录水平的分析,初步证明Bt基因已整合到受体大豆的基因组内.     

利用改良的草丁膦筛选系统快速而有效筛选转基因大豆

为提高大豆(Glycine max(L.)Merrill)遗传转化效率建立了一种快速而有效的草丁膦筛选系统.将刺伤的子叶节外植体接种于含有pCAMBIA3201载体的LBA4404农杆菌溶液.目前利用草丁膦筛选转基因大豆的常规方法是在含有5 mg/L草丁膦的芽诱导培养基和含有3～5 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.利用此常规筛选方法所获得的大多数植株是非转化体,从而导致转化效率变低,为1.6%;而且这种方法极大地延迟了芽的伸长过程,使多数不定芽的伸长发生在农杆菌处理后的21～41周.为此,对常规草丁膦筛选方法进行了改良.首先将外植体放置在不含有除草剂的芽诱导培养基上培养3周,然后转到含有4 mg/L草丁膦的芽伸长培养基上进行筛选.此时,多数不定芽仅在7～12周内便可伸长.当芽长到3～5 cm时,从外植体上切下来转到含有1～5 mg/L草丁膦的根诱导培养上进行进一步的筛选.结果表明,在添加有3 mg/L草丁膦根培养基上,转化效率达到最大值为6.7%.不定芽对根培养基中的除草剂反应迅速,仅在10d天内所有非转化体都变枯死亡.利用这种改良的筛选系统,大多数转基因植株仅在8～16周内便可获得.Southern杂交结果证实了外源基因稳定地整合在大豆基因组中.GUS检测和除草剂抗性分析结果表明,被整合的外源基因在大豆细胞中得到了稳定的表达.     

转抗除草剂基因小麦植株的筛选方法研究

为了降低小麦转bar基因时产生较高比例的假阳性植株,采用测定T0代转基因植株叶片释放NH4 浓度和对T1代植株喷施Basta除草剂等辅助筛选方法,建立了简便有效的转bar基因小麦筛选体系。研究结果表明,2叶期和5叶期叶片释放的NH4 浓度与bar基因PCR检测结果呈极显著相关,相关系数分别为0.86和0.75。对391株T0代再生植株进行叶片释放NH4 浓度测定,筛选到34株转基因植株,其中27株为bar基因的PCR检测所证实。用100 mg/L Basta除草剂对381株T0代植株的后代(3 800余株)进行喷施筛选,根据后代抗性分离筛选到13株T0代阳性植株,与PCR检测结果吻合度达到100%。这两种方法可用于以bar基因为选择标记基因的转基因植株的筛选。     

农杆菌介导植酸酶基因转化大豆的研究

以大豆胚尖为受体,利用农杆菌介导法将来源于泡盛曲霉的植酸酶基因phy转入黑农37和吉林小粒豆中。此法取材方便,操作简单,产生嵌合体的可能性低。在筛选培养基中经草胺膦(1.0 mg.L-1)筛选,获得抗性植株。对获得的草胺磷抗性植株采用除草剂(10%Basta)筛查表型鉴定与目的基因、筛选标记基因PCR分子检测相结合的方法,检测结果直观、可信度高。最终获得5株阳性植株,转化率为0.5%。     

基于不定芽原位诱导的大豆转基因方法

建立了一种新型农杆菌介导的大豆转基因方法(专利公开号:102181479A),以萌发大豆为外植体,最大限度地保持了大豆植株的完整性,在非无菌环境下进行转化,利用草丁膦筛选阳性植株。该方法不需要组织培养,脱离了传统组培的限制。对16个大豆基因型进行转化,经PCR、RT-PCR、qPCR和GUS染色鉴定转基因株系,平均转化率为23%。获得当代转基因植株接近实生苗,收获种子仅需3～4个月。该方法将有利于促进大豆基因功能研究和规模化转化。