桃沙红果实α-甘露糖苷酶基因(α-man)克隆及其在软化过程中的表达分析

α-甘露糖苷酶(α-man)是植物体内N聚糖加工的关键酶,在控制果实软化和延长货架期方面起重要作用.明确α-man在桃果实软化中的生理功能及其调控机制对进一步阐明桃果实的成熟软化机理具有重要意义.以商业成熟期桃(Prunus persica)沙红果实为材料,采用RT-PCR和RACE相结合的方法,克隆桃果实中α-man基因全长cDNA,并利用实时荧光PCR定量技术,检测了采后乙烯利和1-methylcyclo-propene(1-MCP)处理沙红果实软化过程中α-man基因的表达差异.结果表明:桃果实α-man基因的cDNA全长长3 491 bp,包含一个3 075 bp完整的开放阅读框,编码1 024个氨基酸(Genbank登录号:JX310861),N端含有NXT/S的糖基化位点,属糖基水解酶38家族.实时荧光PCR定量技术检测发现对照果实在贮藏第2天出现α-man的表达高峰;外源乙烯处理α-man基因表达高峰提前ld出现,且峰值显著高于对照果实;而1-MCP处理可使α-man基因的表达高峰延迟1d,且后期α-man基因的表达受到极显著抑制.据此推断桃果实α-man基因可能受乙烯生成和乙烯信号转导途径的调控,参与桃果实的软化过程.     

草酸青霉外切葡聚糖酶基因(cbh1)克隆及其在毕赤酵母中的表达和重组外切葡聚糖酶特性分析

木霉的纤维素酶系中通常缺少β-葡萄糖苷酶,导致了终产物抑制,木霉生长速度明显没有青霉快,因此,来源于青霉的纤维素酶受到了越来越多的重视.通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术从草酸青霉(Penicillium oxalicum)M菌株中克隆得到外切葡聚糖酶基因cbh1(GenBank登录号:HQ843504).该基因全长为1 641 bp,无内含子序列,编码547个氨基酸,具有Glu236,Asp238和Glu241典型催化残基,推测属于糖基水解酶第7家族.将cbh1克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,构建重组表达质粒pPIC9-cbh1,电击转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115菌株.阳性重组子经测序及活性分析表明,cbh1基因成功分泌表达,表明来源于草酸青霉的外切葡聚糖酶基因首次在毕赤酵母中获得成功表达.重组酶活性分析表明,其活性可达56IU/mg,最适反应pH、温度分别为6.0和55℃,且pH和温度稳定性均较好.研究结果认为,cbh1基因的克隆丰富了纤维素酶的基因资源,其在毕赤酵母中的成功表达也为该类纤维素酶基因高效工程菌株的构建提供了基础.     

重组海参溶菌酶C端基因(SjLys-C)的可溶性表达和抑菌活性分析

为进一步研究海参(Stichopus japonicus)溶菌酶基因(Sjys)(Genbank登录号:EF036468)中不司片段表达产物的生物特性,本研究通过对其cDNA片段的分析,发现C端基因区域所对应的蛋白质序列中含有非酶活性.根据已知的海参溶菌酶的cDNA序列,设计山含有Nco Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点的特异性引物,从新鲜的海参肠中提取总RNA,以其为模板利用RT-PCR扩增出长度为259 bp的溶菌酶C端(SjLys-C)基因.将该目的基因连接到pET-32a(+)载体上,构建重组质粒pET-32a(+)-SjLys-C,再转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)pLysS,成功地构建了重组蛋白SjLys-C的基因工程菌.利用该工程菌诱导发酵,结果显示它能高效表达出26 kD左右的重组蚩白SjLys-C.经过Western blot分析,该重组蛋白在26 kD左右能够与Penta-His抗体发生特异性免疫反应.对纯化的重组蛋白SjLys-C进行了抑菌特性的分析,结果发现它对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和副溶血弧菌(Vibrio parahae molytic us)有较高的抑菌活性.此外,将该重组蛋白经100℃、40 min处理后,其抑菌能力提高了5％～21％.研究结果表明,重组蛋白SjLys-C基因工程菌能够制备出具有可溶性的、并具有抑菌活性的重组蛋白SjLys-C,在农业和医药等行业中有潜在应用和开发价值.