Pt-mVirD2-GUS质体蛋白编码基因的合成及转化烟草的研究

将拟南芥冷调节基因AtCor15A的质体定位信号肽编码序列、丧失了核定位信号序列的根癌农杆菌VirD2基因突变序列mVirD2和GUS基因序列,拼接成pt-mVirD2-GUS嵌合基因,由CaMV 35S启动子和Tons终止子控制,并经根癌农杆菌介导,成功导入了烟草基因组.     

棉纤维发育重要基因FbL2A的SNPs研究及定位

利用PCR技术在7个四倍体棉种(Gossypium hirsutum L.和G.barbadense L.)和2个二倍体祖先棉种(G. herbaceum L.和G. richmondii U.)中扩增出棉纤维发育重要基因FbL2A, 分析了不同材料间存在的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。根据TM-1和海7124两个材料中FbL2A基因的测序结果, 采用NEBcutter软件分析, 选择BstUⅠ内切酶酶解扩增产物, 利用Mapmaker v3.0b作图软件将FbL2A基因定位到第14染色体。另对该基因在4个陆地棉高强纤维品系间的SNPs位点进行了分析，发现编码区的SNPs位点中存在非同义突变，可能与陆地棉纤维品质等表型相关。     

一种根癌农杆菌介导的GFP亚细胞定位方法的优化

利用根癌农杆菌介导的方法,采用CaMV 35S强启动子启动的含有GFP报告基因的双元表达载体pCAMBIA1301-35S-GFP-AZI1转化烟草表皮细胞。在激光共聚焦显微镜下进行观察,有绿色荧光产生。本文优化了GFP亚细胞定位的方法,即烟草为本氏烟草2～3周龄叶片,菌液OD600值为0.8,共培养时间为32 h,在此条件下能很好地进行GFP的亚细胞定位,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础。     

笋瓜韧皮部蛋白基因启动子的克隆及其功能初探

笋瓜韧皮部蛋白ＰＰ２是一种特的结合几个丁质的凝集素,具有韧皮部组织特异性。为了研究该基因启动子在转基因植物中的表达特性,探索其在植物基因工程中潜在的应用价值,根据发表的序列,用ＰＣＲ方法从笋 瓜基因组中扩增得到了ＰＰ２基因启动子片段。     

小麦醇溶蛋白基因的HPCE和A—PAGE染色体定位及其比较分析

利用高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）技术分离中国春醇溶蛋白获得了４５个不同组分（峰或峰肩），通过过中国春第１，４，６，７部分同源群染色体ＮＴ系和ＤＴ系的ＨＰＣＥ分析，确定了各个醇溶蛋白组分的编码基因所在染色本臂，结果显示，全部蛋白组分均由第１，部６部分同源染色体短臂上的基因编码（即Ｇｌｉ－１和Ｇｌｉ－２位点），其中Ｇｌｉ－Ａｌ，Ｇｌｉ－Ｂ１和Ｇｌｉ－Ｄ１分别编码５，１０和１２个组分Ｇｌｉ－Ａ２，Ｇｌｉ－     

T7RNAP基因的克隆及其质体定位表达载体的构建

为在番茄成熟果实组织中建立T7/T7RNAP质体转基因特异与高效表达系统,本文克隆了原核T7RNAP基因,在添加上质体定位信号肽编码序列后,由番茄果实成熟特异表达启动子PDS和Tnos终止子控制,构成了含有PDS-ptT7RNAP-Tnos基因表达盒的植物基因双元表达载体。该研究为在番茄质体工程中控制外源质体转基因在番茄成熟果实成熟组织中定点表达奠定了基础。     

RPW2表达载体构建及对烟草的遗传转化

将RPW2基因插入表达载体pBI121的表达盒中,构建了RPW2组成型表达载体。通过农杆菌叶盘转化法转化烟草叶片,经卡那霉素筛选、PCR扩增和Southern杂交鉴定证明,RPW2基因已成功转入烟草细胞中,获得6个转基因株系。RT-PCR半定量分析表明,转基因烟草株系的叶片中有RPW2基因的表达。不同转基因株系表达量不同,转基因株系T-R2和T-R4表达量较高。转基因植株叶片上人工接种烟草赤星病菌液检测转基因植株的抗病性,结果表明,与对照植株相比转RPW2基因植株对烟草赤星病抗性显著增强,说明RPW2基因在烟草中也具有抗病能力。另外,转基因株系间RPW2基因表达量虽有差异,但抗病性没有显著差异。     

一个水稻黄绿叶突变体ygl15的鉴定和基因定位

由籼稻品系杂交后代中发现1个黄绿叶突变体,命名为ygl15。为揭示突变体ygl15叶色变异机制,对其进行了表型鉴定和基因定位分析。结果表明,突变体ygl15从苗期开始表现为黄绿叶,叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量较野生型显著下降,并最终导致其农艺性状受到影响,表现为株高、有效穗数、单株总粒数和单株实粒数显著下降,穗长、每穗粒数和结实率的变化不显著,千粒重略有提高;基因表达分析表明,突变体ygl15叶片中,叶绿素合成和光合系统相关的基因表达上调,但血红素合成相关的基因表达下调或不变。遗传分析表明,ygl15的突变表型受1对细胞核隐性基因控制。以突变体ygl15和中花11杂交的F_2群体为定位群体,经过初步定位和精细定位,将ygl15基因定位在水稻第3号染色体上的分子标记M08124～M08175之间,物理距离约79 kb。本研究结果为进一步克隆ygl15突变基因和研究基因功能奠定了一定的理论基础。     

百脉根BIO和豌豆突变位点ELE2的比较基因组定位

豆科两侧对称花的花瓣具有背腹（DV）的分化以及可变的器官内部（IN）非对称性,在大小与形状上显示出不同的发育特征;因而花瓣的发育为克隆决定植物器官的形状与大小的关键基因提供了很好的实验系统。本研究对百脉根中BIO基因进行研究。百脉根bio突变体具有多效性,既影响花器官内部的对称性也影响器官的大小和育性,豌豆ele突变体的表型与bio相似。定位结果表明BIO和ELE2位于豆科基因组的共线性区段,提示BIO和ELE2可能是同源基因突变所致。本研究利用比较基因组定位方法,将BIO和ELE2候选基因锚定在豆科模式植物百脉根和蒺藜苜蓿基因组含有11个同源基因的BAC重叠群上。BIO和ELE2基因的克隆将有助于揭示豆科花瓣形态和大小调控的分子机理,进而为豆科作物遗传改良提供分子理论基础。     

猪圆环病毒2型ORF2／猪白介素2（POIL-2）嵌合基因真核表达载体的构建、表达及在小鼠体内的免疫效果

为了研究猪圆环病毒2型(Porcine circovirus typc 2,PCV2)核酸疫苗,采用重叠延伸PCR(splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR)方法通过--基因柔性接头(linker)(G4S)3,将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2成熟肽基因(PoIL-2)构建成PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因并克隆入pcDNA3.1( )真核表达载体中;筛选阳性重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光和PoIL-2蛋白ELISA方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋(rCap-linker-PoIL-2)生物学活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和只含PCV2 ORF2基因的重组表达质粒PcDNA3.1/OFR2(rpcDNA3.1/OFR2)免疫Balb/c小鼠并检测其免疫效果.结果表明,成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其pcDNA3.1( )重组表达质粒;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2在COS-7细胞浆内进行了表达,表达的rCap-linker-PoIL-2融合蛋白可分别与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap和PoIL-2蛋白的双重生物学活性;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导产生明显的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于rpcDNA3.1/OFR2.     

根癌农杆菌Ti和AT质粒基因组中的分泌型信号肽分析

利用SignalP3.0和PrediSi软件结合L值和TMHMM筛选,对根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58Cereon菌株的Ti和AT质粒所编码的745个ORF编码蛋白中的信号肽进行了预测,发现35条为分泌型蛋白,其中6条属于RR-motif型信号肽,2条蛋白的信号肽为细菌素-信息素型信号肽,新注释了24条分泌型信号肽,其中1条来自Ti质粒,23条来自AT质粒的蛋白。这些信号肽N结构域的长度变化为2￣19aa,平均为6.8aa,H结构域的长度变化为8￣34aa,平均为17.1aa。     

农杆菌介导的蓝色基因转化中国水仙

从矮牵牛(Petunia hybrida)花瓣中分离得到编码蓝色基因F3'5'H(类黄酮3',5'羟基化酶)的Hf2基因(1527 bp),从牵牛(Ipomoea nil)花瓣中分离得到dfr基因(二氢黄酮醇4-还原酶,1212 bp),将正向Hf2片段和反向dfr片段连接到pBRLys双元载体质粒上,得到具有Ubi(ubiquitin)组成型启动子的植物表达载体pU-bi-Hf2-dfr.利用冻融法将双价重组质粒pUbi-Hf2一afr导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105中,菌落PCR鉴定农杆菌转化子.以中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)愈伤组织为材料,进行遗传转化.CTAB法提取130株中国水仙遗传转化再生苗的基因组DNA,进行PCR和PCR-Southem blot检测,获得3株阳性转基因植株.     

两种质粒中gus基因在植物细胞和根癌农杆菌中的表达特性研究

以含有基因转化操作过程中常用的两种质粒载体pBI121和pCAMBIA2301的根癌农杆菌EHA105为材料,分别转化甜瓜子叶,应用组织化学方法检测了甜瓜子叶和子叶培养后的愈伤组织及根癌农杆菌菌液的瞬时转化效果,研究了两种不同的质粒载体上所含的gus基因在根癌农杆菌中和植物细胞中的表达特性。结果表明,不同质粒载体上所含的gus基因的表达特性不同,质粒载体pBI121上所含的gus基因既能在植物细胞中能表达,也能在根癌农杆菌细胞中表达,而质粒载体pCAMBIA2301上所含的gus基因能在植物细胞中表达,但是不能在根癌农杆菌细胞中表达。     

牛ASCL2基因生物信息学分析

在人与小鼠中,ASCL2基因是一个母源表达的印记基因,在早期胚胎和胎盘发育中起重要作用。牛ASCL2基因的印记状态和印记的分子机理还没有被研究。本研究采用生物信息学方法对牛ASCL2基因分子进化、启动子和CpG岛区域以及蛋白的高级结构进行分析和预测,为进一步揭示该基因生物学功能和其分子调控机理奠定基础。对21种哺乳动物ASCL2基因的mRNA序列进化分析表明：这21种哺乳动物问的遗传距离小于0．536,且牛与猪遗传距离最小,为0．106,与基因进化树分析结果一致。CpG岛在线软件预测显示,在牛中,该基因上游5k序列中有三个CpG岛。启动子在线软件预测和转录因子分析相结合显示,启动子最可能位于该基因5’端上游4725--4775bp处CpG岛区域内,此区域包括大量潜在转录因子结合位点,并在4734bp处存在一个TATA框。蛋白质在线软件分析表明,ASCL2基因编码一种螺旋一环一螺旋形转录因子,有仅一螺旋、B一转角和无规则卷曲3种二级结构。     

二氧化硫胁迫诱导拟南芥NIT2基因DNA甲基化修饰

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式。利用亚硫酸氢盐修饰后测序法和甲基化敏感性限制性内切酶-PCR（MSRE-PCR）法,研究SO2胁迫对拟南芥腈水解酶（NIT2）基因序列中胞嘧啶甲基化状态的影响,分析甲基化特征改变在植物胁迫应答过程中的作用。研究发现,30 mg.m-3的SO2连续熏气3 d后,拟南芥植株地上组织细胞中NIT2基因启动子区域CG和CHH（H为C,A或T）位点甲基化水平下降,总甲基化水平降低,但未检出编码区5′端目的片段中CCGG位点甲基化状态的改变。RT-PCR分析表明,SO2胁迫组拟南芥植株地上组织细胞中NIT2基因的转录水平高于对照组。研究结果表明,SO2胁迫导致拟南芥NIT2基因启动子区甲基化水平降低,NIT2基因转录上调,说明SO2胁迫能诱发拟南芥基因胞嘧啶甲基化水平改变,启动子区甲基化水平的降低可能与防御基因的诱导表达有关,胞嘧啶甲基化修饰参与了植物的抗逆生理过程。     

Deg2蛋白酶在拟南芥光损伤D1降解及光保护中的作用

己有研究表明叶绿体内有200种蛋白酶,然而,多数蛋白酶的作用机制尚不清楚,尤其哪些蛋白酶参与了D1蛋白周转。其中Deg2蛋白酶体外实验证明,其参与了光损伤D1蛋白的的初步剪切。为了进一步研究Deg2蛋白酶在植物体内的作用机制,我们筛选了拟南芥De醇蛋白酶功能缺陷型突变体。在120μmol·m-2：·S^-1光照生长条件下,出萨突变体与野生型的生长曲线基本一致;在进一步的高光胁迫（1800μmol·m-2·S^-1）处理及相同的光胁迫处理条件下,无论林可霉素存在与否,突变体PSⅡ的最大光化学效率（Fv／Fm）都和野生型没有区别;利用蛋白免疫印迹实验同样证明了光损伤D1蛋白的降解速度在cfe霞突变体和野生型之间也没有明显区别。我们认为Deg2蛋白酶在光抑制情况下对于光损伤D1蛋白的降解以及PsⅡ的修复不是必需的。     

Cre-LoxP系统调控肠道粘蛋白2启动子活性和特异性

靶基因的高丰度组织特异性表达是基因治疗和制备转基因动物的重要条件。运用Cre-LoxP系统是提高组织特异性启动子转录活性的有效途径之一。本研究利用Cre-LoxP系统,以肠道粘蛋白2启动子调控Cre重组酶表达,转染细胞后检测荧光素酶活性。结果显示,Cre-LoxP系统能使粘蛋白2启动子介导的靶基因在肠细胞SW480中的表达量提高约6倍。细胞特异性检验后发现,Cre-LoxP系统显著弱化了肠道粘蛋白2启动子的细胞特异性。研究结果提示,运用Cre-LoxP系统尽管可以大幅提高弱启动子的活性,但对启动子的特异性要求较高。     

腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因(SREBP2)过表达载体的构建与鉴定

固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM₀01205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。     

云南玉溪烟区两烟草品种叶片光合作用对光和CO_2的响应

通过大田试验,比较了云南玉溪烟区两个主栽烟草品种NC297和K326旺长初期叶片光合作用的光响应和CO2响应曲线特征。结果表明:两个品种的光合特性存在一定的差异,NC297最大净光合速率(Amax)、光补偿点(LCP)、光饱和点(LSP)、表观量子效率(AQY)、表观羧化效率(ACE)均较高,气孔限制值(Ls)低而气孔导度(Cs)大,由于NC297的净光合速率远大于K326,其水分利用效率(WUE)也较高。此外,NC297叶片的光合色素(叶绿素a、b和类胡萝卜素)和可溶性蛋白质含量也较K326高。试验说明,处于所选研究地的海拔高度和生态环境条件下,NC297比K326具有更高的羧化速率、光能利用效率以及对强光的适应能力,光合能力较大,水分利用效率高,其潜在的生产能力也比较大。