白菜WRKY转录因子cDNA全长的克隆及分析

参照拟南芥WRKY转录因子基因保守序列设计引物，利用RT-PCR及RACE技术克隆了白菜WRKY转录因子基因cDNA全长，命名为BcWRKY1 (GenBank登录号为AY836002)。序列分析发现，白菜BcWRKY1基因核苷酸序列长980bp，推导的氨基酸序列编码285个氨基酸残基，与拟南芥AtWRKY18 氨基酸序列的同源性为74%，与拟南芥AtWRKY60同源性为59%；与其它植物WRKY基因的同源性则较低。Southern杂交显示该基因在白菜基因组中为单拷贝。半定量RT-PCR分析表明，用2mmol/L的水杨酸处理后2h~8h，以及用霜霉病菌接种后6h~12h，白菜BcWRKY1基因的表达量最高。     

藜麦β-香树酯醇合酶和鲨烯合酶基因的克隆与表达

为了探明藜麦皂苷生物合成的分子机制,试验以藜麦品种陇藜1号为材料,利用已有的转录数据,通过RT-PCR技术鉴定参与三萜皂苷生物合成关键酶基因,采用生物信息学分析方法进行了基因编码蛋白保守结构域、蛋白二级结构及系统发育树的构建,并利用半定量RT-PCR方法进行了目的基因在籽粒不同发育时期和植株不同部位(根、茎、叶和籽粒)表达水平的研究。试验克隆得到三萜烯皂苷生物合成途径中关键酶编码基因CqSS1、CqSS2和CqbAS的cDNA全长序列。半定量RT-PCR表达分析表明,CqSS1和CqbAS在叶片、籽粒中表达量最高,各基因在籽粒不同发育时期的表达量间无显著差异。本研究对藜麦三萜皂苷生物合成途径中关键酶基因表达模式的研究,将为进一步探明藜麦皂苷生物合成的分子机制及发掘影响藜麦皂苷含量的关键基因奠定基础。     

大豆MYB 转录因子GmMYBZ2 的鉴定、突变分析及原核表达

大豆（Glycine max）GmMYBZ2基因是典型的植物R2R3-MYB转录因子家族成员之一。通过DNAMAN和酵母(Saccharomyces cerevisiae)单杂交系统分别对其蛋白结构和转录活性进行了分析鉴定,并在大肠杆菌(Escherichia coli )中进行了原核表达。GmMYBZ2除含有典型的R2R3-MYB转录因子的结构特征外,在C端含有1个少有的保守氨基酸基序PDLNLELTIS及一个隐藏的锌指结构。基因组序列分析表明,在263～395 bp位含1个132 bp的内含子。为明确GmMYBZ2 C端保守氨基酸基序及锌指结构对目的蛋白转录活性的影响,分别进行了PCR介导的序列删除突变。酵母单杂交系统分析显示,内含子、保守基序及锌指结构对目的蛋白的转录活性均有抑制作用;原核表达显示,目的蛋白能在补充有稀有密码子的大肠杆菌中成功表达。     

刺五加皂苷合成关键酶基因表达的半定量RT．PCR分析

根据己克隆的刺五加鲨烯合酶（squalene synthase,SS）、鲨烯环氧酶（squalene epoxidase,SE）和β-香树酯醇合成酶（B—amyrin synthase,bAS）基因序列信息设计引物,通过半定量RT-PCR分析了SS、阳和bAS基因在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达量的变化。结果表明,SS、SE和bAS基因在各生长发育时期和各器官中均有表达,但表达量差异显著（P〈0．05）,三者均在盛花期表达量最高,之后降低,进入果实成熟期后豁和bAS的表达量迅速回升,阳无显著变化。册和bAS在叶片和根中的表达量较高,舾表达量的最大值出现在叶片和幼茎中。刺五加SS、SE和hAS基因的表达间存在显著的正相关关系（P〈0．05）。研究结果为讲一步分析关锋酶基因对刺百加三萜皂苷生物合成的影响奠定了基础。     

棉花转录因子基因(GhMYB11)的克隆与表达分析

MYB基因家族在植物应对外界生物和非生物胁迫的过程中有重要的调控作用.本研究利用二倍体雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii)基因组数据库,从陆地棉(G.hirsutum)品种鲁棉研32号中克隆到一个新的MYB转录因子GhMYB111(GenBank登录号:HQ234875.1),Cdna全长1 001 bp,开放阅读框828bp.通过与模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和主要作物小麦(Triticum aestivum L.)、玉米(Zea mays L.)、水稻(Oryza sativa L.) MYB蛋白的氨基酸序列比对发现,GhMYB 11蛋白与拟南芥中脱落酸(abscisic acid,ABA)合成和信号传导的重要基因AtMYB13/14编码的蛋白高度相似(E值分别为7e-83和1e-90),含两个高度保守的MYB结构域R2R3及一个转录激活结构域.实时定量PCR分析发现,GhMYB 11基因在黄萎病菌(Verticillium dahliae)侵染、干旱、盐和氧化胁迫处理后的棉花幼苗叶片中表达显著上调.GhMYB11基因可能在棉花生物和非生物胁迫反应中起重要调控作用,是陆地棉品种抗逆性遗传改良的重要候选基因.本研究为利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供了基础材料     

水稻SUSIBA2-like基因的克隆与分析

采用RT-PCR技术克隆了水稻中淀粉去分支酶1(isoamylase1,ISA1)和SUSIBA2-like基因的cDNA序列,全长ORF分别编码了811个和572个氨基酸残基。生物信息学分析显示SUSIBA2-like与SUSIBA2氨基酸同源性为80.7%,同属于第1类WRKY转录因子家族,且三级结构相似,可能具有相同的功能。半定量RT-PCR分析表明,ISA1基因在灌浆期12d胚乳中的表达量达到了1个峰值,在叶、根、茎中不表达;SUSIBA2-like基因也在灌浆期12d胚乳中的表达量达到了1个峰值,在根中没有检测到表达,在叶、茎中有表达。     

甘蓝胞质雄性不育(OguCMS)相关的MYB转录因子BoMYB1的克隆与表达分析

萝卜胞质雄性不育(OguCMS)是目前甘蓝中应用较广的雄性不育类型,MYB转录因子具有调控植物防御应答反应和多个发育过程的作用。本实验以在甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)OguCMS花药中下调10.3倍的EST序列为信息探针,结合电子克隆及RACE技术,得到一个与甘蓝OguCMS雄性不育相关的MYB转录因子全长cDNA,命名为BoMYB1(GenBank登录号:JN703995)。经亚细胞定位预测,该基因定位于细胞核,全长1141bp,包含一个长度为196bp的5’非翻译区、246bp的3’非翻译区和一个699bp的开放阅读框。该基因在花药中具表达优势,并在花药发育晚期出现表达高峰,受植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(JA-ME)的调控,诱导花药发育基因的表达。实验结果提示,BoMYB1可能是参与OguCMS花药发育的重要基因之一。     

月季MYB转录因子基因RcWER-like的克隆及表达分析

MYB转录因子在植物响应盐胁迫过程中起着重要的调控作用。为明确MYB类转录因子RcWER-like生物学功能,本研究以月季月月粉为材料,利用生物信息学分析及实时荧光定量PCR技术研究RcWER-like基因在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组织不同时间点的表达特性。结果表明,依据转录组测序获得的序列信息和月季全基因组信息克隆得到了RcWER-like,该基因全长为882 bp,开放阅读框(ORF)为669 bp,编码223个氨基酸。序列比对发现,RcWER-like在N端具有保守的R2R3-MYB结构域。系统进化树分析结果显示,RcWER-like与桃PpWER-like、梅花PmWER-like、苹果MdWER-like处于同一分支,属于R2R3-MYB类转录因子。实时荧光定量PCR结果表明,RcWER-like基因在盐胁迫处理24 h后表达明显上调,且外施水杨酸和茉莉酸甲酯均可诱导RcWER-like的表达;在盐胁迫下,外施水杨酸和茉莉酸甲酯可诱导RcWER-like的表达,且均高于单独盐或激素处理。此外,月季RcWER-like在盐处理、激素处理、盐与激素综合处理下不同组...     

甘蓝型油菜沪油15中BnaRAV-2-HY15转录因子的克隆及表达分析

基于拟南芥RAV类转录因子的序列,通过电子克隆的方法获得甘蓝型油菜的BnaRAV-2基因序列,再利用RT-PCR方法从甘蓝型油菜沪油15中扩增出编码RAV类转录因子基因BnaRAV-2-HY15,并进行了序列和进化分析。结果显示,该转录因子基因长1119 bp,编码372个氨基酸,含有相对保守的AP2结合域和B3结构域,具有典型的植物RAV类转录因子的结构特征。BnaRAV-2-HY15 和AtRAV2具有相似的三维结构。采用半定量RT-PCR方法对基因表达水平进行分析,发现BnaRAV-2-HY15受到PEG、高盐和低温的诱导表达。BnaRAV-2-HY15基因在沪油15盛花和籽粒发育时期的根、茎、叶、花、蕾和荚中均检测不到明显的表达。     

不同氮浓度下茶树氮合成关键酶基因的表达分析

本研究以10月龄扦插九龙袍茶苗[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze cv.Jiulongpao]为试验材料,通过沙培试验,设4个N浓度(0、60、600、6000 mmol·L-1),每周3次,处理后21周,克隆得到茶叶中氮合成转化关键酶基因:谷氨酸脱氢酶(GDH)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酰胺α-酮戊二酸氨基转移酶(GOGAT)的保守区,在GenBank登录号分别:JN602371、JN602372、JN602373;进行荧光定量PCR检测,发现缺氮下GS、GOGAT基因的表达增强;GDH基因表达显著下降。通过回归分析,GS基因表达与叶片氮含量呈负相关,而GDH与叶片氮含量呈正相关。     

逆境胁迫对苦荞花期总黄酮含量及关键酶基因表达的影响

为探究花期苦荞在逆境胁迫下的总黄酮含量变化及其响应机理,以川荞3号为材料,研究了盐(Na Cl)、干旱(PEG-6000)及UV-B 3种逆境胁迫对苦荞花期各组织中总黄酮含量的影响,及黄酮合成关键酶基因(CHI、F3H、FLS、FLS1)表达量与花期总黄酮含量之间的关系。结果表明:3种胁迫处理后,根、茎、叶、花中的总黄酮含量均有不同程度的增加。在Na Cl胁迫下,根、茎、叶、花中的总黄酮含量明显增加,且在12 h时叶中达到最高值(160.0 mg·g~(-1));当采用PEG-6000处理后,苦荞的根、茎、叶、花中的总黄酮含量均显著升高,且叶、花对PEG-6000胁迫较其它组织敏感;UV-B胁迫也能显著提高苦荞根、茎、叶中的总黄酮含量,且叶中总黄酮含量变化最大,但花中总黄酮含量却呈极显著下降。Real-time PCR分析表明,在上述逆境胁迫下CHI、F3H、FLS及FLS1基因的m RNA量在茎、叶、花中的变化与总黄酮含量变化趋势相一致,推测这些基因可能在花期苦荞对逆境胁迫的适应中发挥重要作用。本研究结果可为解析苦荞在逆境下的响应机制和通过基因工程培育高黄酮苦荞新品种提供理论依据。     

与草菇菌柄伸长相关的bZIP转录因子基因克隆与表达分析

本研究分析了草菇子实体原基、钮扣期菌柄、蛋形期菌柄、伸长期菌柄和成熟期菌柄的表达谱（DGE）,找到一个在伸长期菌柄高表达的基因elnL。PCR克隆测序以及转录组分析结果表明,elnL序列长度1640bp,含有一个内含子,编码526个氨基酸,具有典型的bZIP保守结构域,与双孢蘑菇、双色蜡蘑等担子菌的bZIP转录因子相似性较高。该基因在伸长期菌柄的表达量显著高于其它发育阶段,它可能是一个与草菇菌柄伸长有关的bZIP转录因子。     

14个苹果AP2/ERF转录因子基因的克隆与表达分析

为探究AP2/ERF转录因子在苹果(Malus pumila Mill.)生长发育以及生物或非生物胁迫应答下的功能,本研究利用同源比对和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法,克隆苹果MdAP2/ERF全长cDNA序列并进行生物信息学分析。采用Array技术检测MdAP2/ERF在苹果16种不同组织中的表达情况,RNA-seq技术检测MdAP2/ERF在苹果斑点落叶病菌(Alternaria alternata apple pathotype, AAAP)侵染下的表达特性,RT-qPCR技术检测MdAP2/ERF在NaCl和甘露醇胁迫下的表达模式。结果表明,共获得了MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20-21、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69共计14个MdAP2/ERF基因,其GenBank登录号依次为MG099818-19、MG099821-24、MG099829-30、MG099839、MG099846和MG099855-58,开放阅读框(ORF)分别为966、540、1 260、843、1 056、1 011、1 347、1 047、669、615、1 956、1 455、1 365和1 101 bp。进化分析表明,MdERF12、MdERF37、MdERF20分别属于DREB亚家族A-2、A-4和A-6组;MdERF30、MdERF15、MdERF14/MdERF21和MdERF9/MdERF10/MdERF13分别属于ERF亚家族B-1、B-3、B-5和B-6组;MdAP2D66-69属于AP2亚家族。亚细胞定位预测结果显示,MdERF9-10、MdERF12-15、MdERF20、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69可能位于细胞核;MdERF21可能位于线粒体。Array分析结果显示,14个MdAP2/ERF在16个检测组织中均有不同的相对表达水平。RNA-seq结果显示,MdERF12、MdERF14、MdERF15、MdERF20和MdAP2D66/67/69响应斑点落叶病菌侵染;在150 mmol·L^-1 NaCl处理下,MdERF10、MdERF12、MdERF13、MdERF15、MdERF20、MdERF30和MdERF37转录水平上调,而MdERF14和MdAP2D68转录水平下调;在300 mmol·L^-1甘露醇处理下,MdERF10、MdERF30、MdERF37和MdAP2D66-69转录水平上调,MdERF14转录水平下调。综上表明,MdAP2/ERF基因呈组成型表达,并受斑点落叶病菌、NaCl或甘露醇胁迫诱导或下调,可能参与调控苹果生物胁迫和非生物胁迫应答的过程。该研究结果为进一步揭示AP2/ERF转录因子调控苹果生长发育及逆境胁迫的机理奠定了理论基础。     

番茄NAC转录因子SlNAP2的克隆、表达及功能分析

为了探究NAC转录因子在番茄生物胁迫响应中的功能,本试验通过逆转录PCR(RT-PCR)技术从番茄中克隆得到一个NAC转录因子基因SlNAP2,其cDNA全长（ORT）1 227 bp,包含142 bp的5′非编码区和257 bp的3′非编码区以及一个长度为828 bp编码275个氨基酸的开放阅读框（ORF）,含1个NAM结构域。同源序列比对及系统进化树分析结果表明,SlNAP2与潘那利番茄SpNAP2亲缘关系最近,并与其他茄科NAC聚为一组,而与菊科、葫芦科、葡萄科、大戟科、杨柳科NAC的亲缘关系较远,在系统发育树上处于不同的分支。生物信息学分析结果显示,SlNAP2相对分子质量为31 877.23 Da,理论等电点pI为8.56,该基因编码的蛋白不存在跨膜结构。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明,SlNAP2基因表达具有组织特异性,在番茄茎中的表达量最高,并参与了番茄对青枯菌胁迫及水杨酸和茉莉酸刺激的响应。利用病毒诱导的基因沉默（VIGS）技术发现,沉默SlNAP2后降低了植株对青枯病的抗性,表明SlNAP2在番茄抗青枯病过程中起正调控作用。本研究为深入探讨SlNAP2基...     

独行菜LaBBX基因低温表达响应与密码子偏性分析

BBX是调控植物非生物胁迫相关基因表达,响应植物逆境胁迫的重要锌指蛋白类转录因子。为探究BBX在独行菜(Lepidium apetalum)幼苗耐受低温生长中的表达响应及其密码子偏好性,本研究基于独行菜转录组数据,筛选独行菜BBX编码基因的cDNA序列,并从独行菜幼苗中克隆获得全长733 bp的基因编码区序列,命名为LaBBX。序列分析表明,LaBBX由242个氨基酸组成,包含2个B-box锌指蛋白结构域,蛋白分子量为61.66 kDa,等电点为5.09,无信号肽和跨膜区。独行菜幼苗受低温胁迫时,LaBBX基因显著上调表达,6 h上调表达至21倍,且24 h内均呈现高水平表达,说明该转录因子可能在独行菜幼苗受低温胁迫时起重要作用。偏好性分析结果显示,独行菜LaBBX基因的ENc、CAI值和GC含量分别为55.453、0.244和46.78%,其密码子使用偏性较弱,相对偏好使用AT,高频密码子有8个,CDS序列及RSCU聚类分析中与十字花科植物最相近;其偏好性的形成与突变和自然选择等诸多因素相关,酵母菌表达系统更适合作为LaBBX基因的异源表达受体,拟南芥是适宜LaBBX基因的遗传转化受体。本研究为了解独行菜LaBBX基因的异源表达及基因功能提供了重要参考。