水稻中介体亚基的表达谱分析及亚细胞定位

中介体是一种大分子蛋白复合物,在真核生物的转录调控中发挥重要的作用。基因的时空表达控制着植物的生长和发育。虽然近年来拟南芥(Arabidopsis thaliana)中介体亚基的功能研究进展迅速,但对其基因的时空表达信息知之甚少。为研究水稻(Oryza sativa)中介体亚基基因的表达模式,以拟南芥中介体亚基基因为查询序列,在NCBI核酸数据库上进行搜索,共获得24个水稻中介体亚基基因,其中除了Med19存在两个拷贝以外,其余22个亚基基因均为单拷贝。利用水稻21个组织共59个样本的芯片数据,对23个中介体亚基基因的表达数据进行聚类,结果表明,OsMed12的表达组织特异性最强,其次为OsMed11,其他21个亚基基因表达无明显规律,较接近组成型表达。以GUS为报告基因的OsMed8启动子活性分析结果与其表达谱结果一致,可以看出在植株的分生组织、营养生长早期和生殖生长初期表达较强。亚细胞定位结果显示,OsMed6被定位在细胞核中;OsMed8定位在细胞核和细胞质膜中。本研究获得了水稻中介体基因的表达模式和蛋白亚细胞定位的重要的数据,对于进一步研究水稻中介体亚基的功能提供了很有价值的参考信息。     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。     

激发子隐地蛋白基因介导的烟草抗病性研究

摘要：从隐地疫霉（Phytophthora cryptogea）中克隆cryptogein（Crypt）激发子基因。针对病原菌侵染和Crypt基因的特点，选用能在根、茎、叶等的表皮细胞中特异性表达的、弱组成型并受病原菌诱导的水稻(Oryza sativa )苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）的启动子；同时为了使表达的cryptogein蛋白能分泌到细胞外，更好地与植物细胞膜受体互作，在Crypt基因前还融合了病程相关蛋白PR1b的信号肽; 然后将此融合基因构建于植物表达载体CHF3中。通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefancens)介导的叶盘转化法转入烟草(Nicotiana tabacum )。经卡那霉素抗性筛选获22株再生植株，PCR检测都为阳性，部分植株的Southern杂交结果表明,Crypt基因已以低拷贝（1～2个）整合到烟草基因组中。抗病性测定结果表明,转化植株对烟草黑胫病菌(P. parasitica var. nicotianae )、赤星病菌(Alternaria alternata )和野火病菌(Pseudomonas syringae pv. tabaci )的抗性均有提高。     

桃WRKY转录因子PpWRKY18克隆及表达分析

为了探究WRKY转录因子在植物抵抗逆境胁迫方面的重要作用,本研究从桃中克隆PpWRKY18基因,通过生物信息学分析PpWRKY18蛋白含有典型WRKY功能结构域。系统进化树分析表明,桃PpWRKY18与蔷薇科物种的亲缘关系最为相近。生物信息学预测PpWRKY18蛋白定位细胞核,并通过农杆菌瞬时注射烟草叶片证实PpWRKY18定位于细胞核。对PGEX-PpWRKY18融合蛋白进行诱导表达,发现PpWRKY18融合蛋白主要在包涵体中表达。荧光定量PCR结果表明,PpWRKY18受干旱诱导表达量上升,复水后PpWRKY18表达量下降。生物信息学预测显示,蛋白磷酸酶蛋白家族(Protein Phosphatase 2C)、C2H2蛋白家族(PpZAT5)、ERF蛋白家族(PpERF9)、BHLH蛋白家族(PpBHLH92)可能与PpWRKY18蛋白互作,推测PpWRKY18蛋白通过与这些蛋白互作协同响应干旱胁迫。本研究为探索PpWRKY18响应干旱的分子机制提供了理论依据。     

小麦翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)与索马甜类蛋白(TLP)的相互作用

翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)分布于真核细胞中,参与包括有丝分裂、DNA损伤修复和植物抵御病原物侵染等多种生物进程。索马甜类蛋白(thaumatin-like protein,TLP)是一类植物中的病程相关蛋白,参与多种植物响应病原物侵染的过程。本实验室前期研究证明Ta TCTP参与小麦(Triticum aestivum)抵御小麦叶锈菌侵染(Puccinia triticina)的防卫反应。本研究关注小麦Ta TCTP和Ta TLP之间的相互作用,分别构建了用于酵母双杂交(yeast two-hybrid)和双分子荧光互补(Bi-molecular fluorescence complementation,Bi FC)实验的载体。通过酵母双杂交实验,发现同时携带表达TCTP和TLP载体的酵母AH109可以在SD-Leu/-Trp/-His和SD-Leu/-Trp/-His/-Ade培养基上生长,并可检测到报告基因α-半乳糖苷酶基因(α-galactosidase gene,MEL1)活性,表明Ta TCTP和Ta TLP可发生物理互作。通过Bi FC实验,发现共同转化表达TCTP和TLP载体的烟草(Nicotiana benthamiana)下表皮细胞的细胞质中可观察到强烈的黄色荧光,表明Ta TCTP和Ta TLP可在细胞质中发生相互作用。本研究为深入研究TCTP在小麦抵抗小麦叶锈菌侵染中的作用机制奠定基础。     

优化的VHb基因和融合杀虫基因在烟草中的表达

将人工合成的、密码子优化后的透明颤菌血红蛋白(VHb)基因(vgbM)与含有融合杀虫基因(GFMcryIA和CPTI)表达载体pGBIF4ABC构建成双价基因植物高效表达载体pGBIF4ABCVHB,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化烟草(Nicotiana tabacum),经PCR及Southernblot检测,证实了双价基因在32株转基因烟草基因组中整合。Westernblot检测证实了vgbM基因的表达,杀虫实验表明,融合杀虫基因表达的毒蛋白具有杀虫活性,转基因烟草平均每株干重高于非转基因烟草植株8%。表明VHb基因和融合杀虫基因烟草在烟草中的表达可使烟草可增产,又具抗虫性。     

与RBSDV外壳蛋白P10互作植物因子的筛选与验证

目前,我们对水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)编码的外壳蛋白P10在该病毒侵染过程中的作用了解甚少。本研究利用酵母双杂交技术,以P10为诱饵钓取拟南芥cDNA文库,得到与P10互作的真核翻译起始因子eIF5A-2。通过分别构建猎物和诱饵载体共转化酵母,结果表明P10与AteIF5A-2在酵母中互作。利用农杆菌转染烟草表皮细胞瞬时表达体系发现,P10和AteIF5A-2形成融合荧光蛋白后,荧光主要形成囊泡状的结构。通过荧光共定位实验分析发现,P10与AteIF5A-2能够共定位。本研究结果进一步揭示了水稻黑条矮缩病毒的致病机制。     

利用免疫共沉淀技术研究RSV CP、SP和NSvc4三个蛋白的互作情况

为了检测水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)CP、SP和NSvc4蛋白自身和两两之间的互作关系,首先通过PCR扩增获得了分别融合有HA或c-Myc标签的RSV CP、SP和NSvc4基因,并将其插入到植物表达载体pEGAD或pKYLX71:35S2中。重组质粒转化农杆菌EHA105后,将含有不同重组质粒的农杆菌菌液混合后注射烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。提取烟草中瞬时表达的蛋白,以HA抗体或c-Myc抗体进行免疫共沉淀实验,最后免疫混合物通过c-Myc抗体或HA抗体进行Western blot检测,确定蛋白的互作情况。结果表明,RSV CP蛋白自身能够发生互作,而CP与SP,CP与NSvc4,SP与SP,SP与NSvc4,及NSvc4与NSvc4蛋白之间均未有检测到互作现象。     

CIDEC的亚细胞定位及其功能初步研究

CIDEC(也称FSP27)高表达于脂肪组织,可以促进细胞内脂肪积累等。为探究CIDEC促进脂滴融合的机制,本研究利用脂肪酸处理HepG2细胞,测定细胞内脂滴直径和数目的变化,发现处理后脂滴的直径和数量无显著性差异。将含有CIDEC的重组载体转染细胞,脂肪酸处理24 h后测定脂滴直径和数量变化,进一步利用共聚焦显微镜分析其亚细胞定位,并检测与脂滴生成、生长等相关基因表达量的变化。结果表明,过表达CIDEC后脂滴的直径显著增加,脂滴的数量极显著减少;亚细胞定位发现,CIDEC位于脂滴周围。此外,PLIN1、CREB1、CREB8的表达量有所下降,CIDEA、CFD表达量有所上升,推测CIDEC可能与这些蛋白互作引起脂滴融合。本研究结果为探究CIDEC促进脂滴融合的分子机制奠定了基础。     

一种根癌农杆菌介导的GFP亚细胞定位方法的优化

利用根癌农杆菌介导的方法,采用CaMV 35S强启动子启动的含有GFP报告基因的双元表达载体pCAMBIA1301-35S-GFP-AZI1转化烟草表皮细胞。在激光共聚焦显微镜下进行观察,有绿色荧光产生。本文优化了GFP亚细胞定位的方法,即烟草为本氏烟草2～3周龄叶片,菌液OD600值为0.8,共培养时间为32 h,在此条件下能很好地进行GFP的亚细胞定位,为进一步研究新基因的亚细胞定位和瞬时表达奠定了基础。     

适用于板栗疫病菌分子相互作用研究的双分子荧光互补系统

双分子荧光互补技术近年来已广泛应用于研究体内蛋白质相互作用。为建立适合于板栗疫病菌的体内蛋白质相互作用检测体系,本研究以质粒pCPXHY2和pCPXG418为骨架,构建了由板栗疫病菌pgd启动子控制的、以增强型黄色荧光蛋白EYFP为报告基因和以潮霉素和G418抗性为选择标记的双质粒系统pCPXHY2N155和pCPXG418C156。质粒pCPXHY2N155携带EYFP的1~155位氨基酸残基的编码序列,pCPXG418C156携带EYFP基因的156~239位氨基酸残基的编码序列。为验证该质粒系统的有效性,将板栗疫病菌异质三联体G蛋白的β和γ亚基基因分别与pCPXHY2N155上的N155和pCPXG418C156上的C156相连,获得重组质粒pCPXHY2N155β和pCPXG418C156γ。将这两个重组质粒共转化板栗疫病菌野生型菌株EP155,在转化株中观察到明显的黄色荧光,表明Gβ和Gγ在细胞中发生了相互作用。本研究所构建的双分子荧光互补系统,为今后研究板栗疫病菌分子相互作用提供了新的技术手段。     

雄性不育烟草atp6基因育性相关生物信息学分析

线粒体基因atp6与多种植物细胞质雄性不育(CMS)关系密切。为探索atp6基因致烟草CMS的潜能,以2对烟草不育系和相应保持系为材料克隆atp6基因,测序结果显示不育系与保持系atp6基因间有6个碱基差异。进一步的生物信息学分析结果表明,6个碱基差异导致4个预测氨基酸残基差异及差异残基所处区域的亲/疏水性改变,不育系atp6基因预测蛋白在二级结构和结构域上均呈现出周期结构(主要为α-螺旋)增加而非周期结构(主要为无规卷曲)减少的趋势,不育系atp6基因的碱基差异能在一定程度上引起编码亚基空间结构类型发生改变。推测atp6编码亚基尤其是亚基结构域空间结构类型的改变可能干扰线粒体F₀F₁-ATP合成酶的功能,从而成为影响烟草育性的因素之一。     

反向重复RNA介导转基因烟草对花生条纹病毒抗性

构建携带花生条纹病毒（Peanut stripe virus, PStV）外壳蛋白基因（cp）反向重复序列植物表达载体pKcp，转化农杆菌菌株GV3101，叶盘法转化本生烟，卡那霉素筛选得到的转化植株5~6叶期摩擦接种PStV。通过症状观察和ELISA检测，T0代转基因烟草植株87%表现免疫，T1代不同系植株的免疫比例为60~100%，T2代多数系植株免疫比例达到100%。利用PStVcp特异探针对转基因植株T1代进行特异siRNA的Northern blot检测，转基因植株都含有不同量的特异siRNA，而非转基因植株不含特异siRNA；接种前，免疫植株比感病植株体内siRNA含量高；不同转化系免疫植株在接种前、接种15天和50天后的叶片中都检测到特异siRNA，同一植株不同时期，siRNA含量相对稳定；不同转化系植株体内siRNA含量存在差异。本试验成功利用dsRNA获得对PStV具有较高比例抗性的转基因烟草植株。     

利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术快速鉴定两个马铃薯晚疫病抗性相关EST片段EL732276和EL732318的功能

马铃薯晚疫病是由致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)deBary]引起的第一大作物病害,目前已严重限制了全球马铃薯的生产和发展。马铃薯晚疫病抗性分子机理的研究一直是抗病育种中的热点问题。本研究利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,在本氏烟草(Nicotina benthamiana)中沉默两个马铃薯晚疫病水平抗性相关的基因片段EL732276和EL732318。目的基因沉默后的烟草接种晚疫病菌P.infestans,根据病斑生长速率LGR(length grow rate)来了解这两个基因是否参与烟草对晚疫病的抗性反应。结果表明,目的基因片段EL732276和EL732318被成功地插入烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)载体中。利用携带八氢番茄红素脱氢酶基因(phytoene desaturae,PDS)的TRV重组载体病毒接种烟草,感染病毒的烟草植株表现光漂白现象,说明VIGS体系有效。用携带目的片段的重组载体病毒TRV:EL732276和TRV:EL732318感染烟草植株,一个月后,烟草叶片接种晚疫病菌P.infestans,从接种P.infestans的烟草叶片上可以看出,感染TRV空载体的对照烟草叶片上病斑扩展速率非常缓慢,而目的片段EL732276和EL732318沉默后的烟草叶片可见明显的水浸状病斑和少量白色的晚疫病菌菌丝。进一步的分析表明TRV:EL732276重组载体病毒侵染的烟草接种P.infestans后LGR值极显著上升,TRV:EL732318病毒侵染的烟草接种P.infestans后LGR值显著上升,表明EL732276和EL732318同源基因在烟草中沉默后,烟草对P.infestans的抗性显著降低。研究结果认为,病毒诱导的基因沉默技术可在本氏烟草中初步快速鉴定马铃薯抗病相关基因的功能。     

烟草DREB-like转录因子的克隆与鉴定

在NCBI网站BLAST得到5个烟草表达序列标签(EST),据此设计引物,从烟草(Nicotianabenthamiana)品种本塞母氏中分离出2条DREB(dehydration-responsiveelementbindingprotein)-like转录因子基因,分别命名为NbDREB1和NbDREB2。与相关AP2/EREBP类转录因子比对结果显示,NbDREB1和NbDREB2都具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类AP2区特征,并且都能在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达。酵母单杂交结果显示,都不具有激活功能。连接pGADT7反式激活载体进行酵母单杂交结果显示:NbDREB1能与DRE顺式作用元件结合,NbDREB2则不能,表明NbDREB1为抑制型DREB类转录因子。比较NbDREB1和NbDREB2的AP2区发现:两者在第2位和第49位氨基酸处不同,NbDREB1为Y和K,NbDREB2为N和R。     

基于野外调查信息的山东省临朐县典型烟田土壤系统分类

以山东省临朐县为研究区域,通过其典型优质烟田的野外土壤调查信息尝试建立相应的土系.结果表明:临朐县8个植烟片区9个典型优质烟田,主要为分布在高丘坡上的旱地,可归为淋溶土、雏形土和新成±;在系统分类上可划分为3个土纲、3个亚纲、5个土类、6个亚类、6个土族和8个土系;不同的土系在植烟优劣方面存在一定差异,属于淋溶土的土系有效土层深厚,但有黏化层可能妨碍根系下扎;属于雏形土和新成土的土系颗粒较粗而通透性好,养分含量较低易调控,但有效土层偏薄.     

Arsenic Concentration in Tobacco Leaves: A Study on Three Commercially Important Tobacco (Nicotiana tabacum L.) Types

In recent years, arsenic (As) has received increased attention as humans may be exposed to it through occupational and environmental exposure. Tobacco (Nicotiana tabacum L.) like other crops can uptake this element from the soil, which may lead to human exposure. Here, we report on a survey on arsenic in cured or processed tobacco leaves obtained from Africa, Asia, Europe, South and North America. A total of 1,431 leaf samples of flue-cured, burley, and Oriental tobaccos were obtained from various sampling locations during 2002 to 2004. Arsenic concentration in the samples averaged 0.4?±?0.6 μg g^?1 as determined by inductively coupled plasma-mass spectrometry. Recorded values from most samples showed that concentrations of arsenic were usually found at the lower end of the distribution. Significant differences were found among tobacco types, sampling locations, and crop years. Arsenic concentrations were rather low in the majority of regions investigated, which is compatible with data from the literature. However, sample size was small and sampling geographically restricted. Our results would need to be validated with a larger dataset.