水稻白叶枯病菌蛋白质激发子HarpinXoo诱导植物的防卫反应

摘要：含质粒pHRF4的表达菌株BLHR4在培养基中经IPTG诱导，16 h Harpin表达接近最高量。用不同浓度的HarpinXoo喷雾处理烟草(Nicotiana tabacum L.)、油菜(Brassica campestris L.)和番茄(Lycopersicon esculentum Mill.)，对烟草花叶病毒(TMV)、油菜菌核病(Sclerotinia sclerotiorum (lib.) de Bary)和番茄灰霉病(Botrytis cinerea Pers.)均表现较好的诱导抗病效果。以浓度为100μg/mL的HarpinXoo处理烟草后，分别测定叶片中与防卫反应相关的一些生理指标的变化，结果表明，处理叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（PO）和多酚氧化酶（PPO）活性都有不同程度的增强。三种酶活性高峰分别在处理后24、12和3 h出现，分别比清水对照增加110.1%、211.2%和273.0%；同时，两个病程相关蛋白（pathogenesis-related protein，PR）基因PR-1b和PR-1a在HarpinXoo处理24 h后被诱导显著表达，36 h时达到最高表达水平。这表明HarpinXoo与HarpinEa一样能够诱导烟草不同抗病信号通路的启动，从而使植株获得抗病性。     

印度梨形孢诱导烟草对黑胫病的抗性及其机理的初步研究

印度梨形孢(Piriformospora indica)是分离自印度塔尔沙漠的植物根系内生真菌,能够诱导多种植物对生物和非生物逆境产生抗性,目前已作为一种模式真菌用于内生真菌与植物互作关系的研究。为了研究印度梨形孢对烟草(Nicotiana tobacum)抗黑胫病的影响,本研究采用烟草疫霉菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)分别接种根部有印度梨形孢定殖与未定殖的烟草,观察接种后根部有印度梨形孢定殖与未定殖的烟草发病情况,测定抗病相关防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)的活性变化及抗病相关基因的表达量,并通过平皿对峙试验研究印度梨形孢对烟草疫霉菌生长的影响。结果表明,接种烟草疫霉菌后,根部有印度梨形孢定殖的烟草发病严重度要显著低于对照;接种烟草疫霉菌后第1~10 d,根部有印度梨形孢定殖的烟草叶片中防御酶PAL、POD和PPO活性高于对照,在第1 d,PAL活性是对照烟草的3.99倍,在第2 d,POD活性是对照烟草的1.5倍,在第4 d,PPO活性是对照烟草的2.66倍;实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,q RT-PCR)结果显示,接种烟草疫霉菌后第6~96 h,根部有印度梨形孢定殖的烟草叶片中抗病相关基因PR1b、P450-2、hrs203J、Nm IMSP和P450-1的表达量高于对照;在第12 h,PR1b、P450-2、hrs203J的表达量分别是对照烟草的3.8、15.7和3.1倍,在第48 h,Nm IMSP的表达量是对照烟草的2.6倍,在第72 h,P450-1的表达量是对照烟草的1.5倍;平皿对峙试验结果显示印度梨形孢对烟草疫霉菌的生长没有抑制、重寄生作用。研究结果表明,印度梨形孢可显著提高烟草对黑胫病的抗性,对黑胫病的抗性不是通过印度梨形孢分泌的抗菌物质实现的,是与烟草中抗病相关基因表达量的上升、防御酶活性的提高有关。本研究初步揭示了印度梨形孢诱导烟草抗黑胫病的相关机理,为进一步深入研究烟草黑胫病的生物防治及其机理提供基础资料。     

虫害诱导烟草抗性对斜纹夜蛾取食及解毒酶的影响

为探究不同虫害诱导抗性烟草(Nicotiana tabacum L.)对斜纹夜蛾(Spodoptera litura Fabricius)取食和解毒生理的影响,本研究以烤烟品种雄性不育K326为供试材料,观察斜纹夜蛾幼虫对棉铃虫[Helicoverpa armigera(Hübner)]诱导烟草、斜纹夜蛾诱导烟草、烟蚜[Myzus persicae(Sulzer)]诱导烟草的取食选择,以机械处理(打孔、针刺)和未作任何处理的烟草作为阳性和阴性对照,检测分析了取食各虫害处理烟草后斜纹夜蛾体内乙酰胆碱酯酶(AchE)、羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、多功能氧化酶(MFO)等酶活性的变化。结果表明,斜纹夜蛾初孵幼虫喜食阳性对照打孔和烟蚜诱导处理后的烟叶,而相对避免取食同种昆虫诱导后的烟叶,3龄幼虫亦喜食阳性对照打孔诱导烟叶。取食各虫害处理烟叶后斜纹夜蛾体内的AchE活性均被诱导升高,其中烟蚜处理的AchE活性最高,在48 h时较CK升高了65.17%。棉铃虫、斜纹夜蛾和烟蚜处理在48、48和4 h时分别诱导CarE、MFO、GST活性较CK升高14.38%、72.22%和47.47%,而三种处理对应的MFO和GST,CarE、MFO分别在12和48,48、4 h时升高后与CK没有显著差异(P>0.05),斜纹夜蛾处理的GST活性和烟蚜处理的CarE活性均在48 h时被明显抑制,仅为CK的55.67%和81.05%。说明斜纹夜蛾对不同抗性烟草存在取食差异,取食抗性烟草均可激活斜纹夜蛾AchE活性,不同抗性处理下其他酶活性随着时间呈现特异性变化。本研究可为斜纹夜蛾在烟田中的综合防治研究提供思路和研究基础。     

苯并噻二唑(BTH)诱导小麦对条锈病抗性的研究

小麦条锈病是小麦生产中的重要病害之一,为了明确苯并噻二唑(Benzothiadiazole,BTH)对小麦条锈病的诱导抗性作用,分别以BTH处理后的苗期和成株期小麦为试验材料,诱发接种小麦条锈菌后调查小麦的发病情况及防治效果。温室苗期试验结果表明,与对照相比,不同浓度BTH处理后,小麦抗锈性明显提高,病情指数降低29.69~49.77,防治效果可高达90%左右,不同浓度处理之间有一定差异,但与对照相比差异极显著;BTH诱导的最佳浓度为0.3 mmol·L-1,BTH喷雾处理后6~7 d小麦诱导抗锈性表达最强,诱导抗性的持久期在15 d以上。田间成株期试验结果表明,不同浓度处理诱导的小麦抗锈性无明显差异,浓度为0.3 mmol·L-1的BTH诱导处理小区小麦的产量最高,千粒重最重,为42.21 g,增产最高达19.3%。小麦在分蘖期、拔节前期和分蘖期+拔节前期喷施BTH,都能诱导小麦抗条锈性增强,病情指数显著降低,防治效果分别为43.07%、47.43%和50.01%,增产13.4%~16.9%。综上所述,BTH可以诱导小麦产生抗锈性,对小麦条锈病防治起到积极作用。     

硅对水稻病程相关蛋白活性和酚类物质含量的影响及其与诱导抗性的关系

为阐明硅提高水稻抗稻瘟病的生理机制,采用室内溶液培养试验,研究了硅对接种稻瘟病菌后水稻叶片的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶活性以及总可溶性酚和木质素含量的影响。结果表明,接种稻瘟病菌能诱导几丁质酶活性的快速上升,不施硅处理的几丁质酶活性在第2 d达到第一个峰值后就开始下降,而施硅处理的几丁质酶活性则继续上升直到第4 d才开始下降,从第4～8 d显著高于不施硅处理。β-1,3-葡聚糖酶活性在接种后的第4 d之前均上升缓慢,处理间差异不显著;第4 d后开始上升,到第8 d达到最大值;不施硅处理上升更快,显著高于施硅处理。接种稻瘟病菌能诱导水稻叶片总可溶性酚含量快速上升,施硅处理和不施硅处理分别在接种后的第3和第4 d达到峰值,并开始快速下降;施硅能显著提高总可溶性酚含量。水稻叶片中的木质素含量在接种后的第1 d快速上升,并维持较高水平,施硅处理显著高于不施硅处理;但在感病后期（第6 d）,施硅处理开始显著低于不施硅处理。     

秦川牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)N端序列的原核表达及纯化

为了研究牛天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的功能,探求转基因抗胞内感染菌牛新材料创制的功能基因,本实验应用RT-PCR方法从秦川牛(Bos taurus)外周血中扩增出Nramp1编码基因N端序列,并将其克隆到pMD18-T simple载体,酶切后连接于pGEX-4T-1表达载体,命名为pGEX-N2。将重组质粒pGEX-N2转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测GST-Nramp1-N融合蛋白表达,并筛选最佳诱导条件,用谷胱甘肽Sepharose4B介质分离纯化该融合蛋白。结果表明,牛Nramp1N端编码序列长186bp,与GenBank中的相应的牛基因序列(U12862.1)对比存在一个碱基差异,致使其编码的第49位氨基酸为丙氨酸。构建的牛Nramp1N端表达重组质粒pGEX-N2,于35℃、0.1mmol/LIPTG、诱导10h,在大肠杆菌中高效表达,表达产物的分子量为33kD。结果为进一步研究牛Nramp1在机体抵抗胞内菌感染中的作用并为利用该基因进行转基因抗病牛的培育提供了实验依据和实验材料。     

RNA干扰V1和C1提高番茄植株对番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的抗性

为了获得高抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)番茄材料,本研究通过人工设计以TYLCV病毒基因V1、C1为靶标的双链RNA(dsRNA),通过农杆菌介导法转化番茄,探索RNAi技术在番茄抗TYLCV中的防御效果。结果表明,通过RNAi技术干扰TYLCVV1和C1基因可以延缓病毒症状的发生,提高番茄植株对TYLCV的抗性。田间试验结果发现,以TYLCV V1和C1为靶标的RNAi株系RNAi-CP-2和RNAi-Rep-12,不仅可以干扰病毒V1、C1的表达,而且可以干扰TYLCV其他4个基因V2、C2、C3和C4,表明RNAi技术可以在靶标基因附近传递,影响相邻其他基因的表达。本研究结果为番茄抗病毒研究奠定了理论基础。     

PR结构域蛋白1(PRDM1)慢病毒表达载体的构建及其对脐带间充质干细胞(hUC-MSC)向生殖细胞诱导分化的影响

PR结构域蛋白1基因(PR domain containing 1,with ZNF domain,PRDM1)作为原始生殖细胞(primordial germ cell,PGC)形成过程中的一个重要起始因子,在胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)向PGC的发育分化过程中发挥重要作用。为了研究其在成体干细胞诱导分化中的作用,本研究PCR克隆获得小鼠(Mus musculus)PRDM1基因(GenBank登录号:JX154081.1),构建了PRDM1慢病毒表达载体pCDH-PRDM1,通过293T细胞包装病毒,用携带有PRDM1基因的病毒颗粒转导脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)。结果表明,PRDM1基因成功在hUC-MSC中超表达;PRDM1基因能引起生殖相关基因胚胎特定时期抗原-1(stage-specific embryonic antigen-1,SSEA-1)、多能性相关蛋白3(developmental pluripotency associated 3 Dppa3,STELLA)、干细胞生长因子受体(stem cell growth factor receptor,C-KIT)和性别决定基因-同源盒2(sex determining region Y-box 2,SOX2)的上调,为进一步研究该基因的功能和提高干细胞向生殖细胞诱导分化研究奠定了一定的基础,并且为hUCMSC向生殖细胞的诱导分化提供了一个新的思路。     

黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。     

维生素E对α-生育酚转移蛋白(α-TTP)表达的影响及其作用机制研究进展

α-生育酚转移蛋白(α-tocopherol transfer protein,α-TTP)是决定机体维生素E含量的重要蛋白,对于维生素E在肝脏中沉积及向外周组织转运起着关键调控作用。α-TTP基因突变后可引发维生素E缺乏性共济失调症,导致血浆中维生素E含量极低,同时伴随有进行性神经退化症状。本文重点综述了α-TTP的生理功能、作用机制以及维生素E对α-TTP表达影响的研究进展,并对其未来的研究方向进行了展望,从而为α-TTP转运α-生育酚的分子机制研究及维生素E吸收、代谢途径等相关研究提供理论参考。     

人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin),gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202,通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗,将外源gna基因导入到3个高产小麦(TriticumaestivumL.)品种中,获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证,确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明,小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集,并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphumpadi)试验,蚜口密度抑制率从19%～73%不等,部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中,并可有效地增强小麦的抗蚜能力,为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

钙调磷酸酶催化亚基A基因(PPP3CA)在不同品种鸭发育早期肌肉中的表达及其与肌纤维特性的相关性

钙调磷酸酶催化亚基A(protein phosphatase 3 catalytic A,PPP3CA)是PPP3C在骨骼肌中的主要亚型,在肌纤维分化中起重要作用.为研究PPP3CA基因在不同品种鸭(Anas platyrhynchos domestica)发育早期肌肉中的表达规律及其与肌纤维特性的相关性,本研究选用生长速度差异较大的金定鸭和高邮鸭,采用实时荧光定量PCR检测鸭13、17、21、25和27胚龄及7日龄胸肌和腿肌中PPP3CA mRNA的表达水平.结果表明,两鸭种同一肌肉组织中PPP3CA mRNA的表达表现出显著的时间特异性,而品种和性别效应并不显著.两鸭品种胸肌和腿肌中PPP3CA mRNA的表达模式虽不同,但均是在13胚龄(13embryonic day,E13 d)时最高,且在出雏后7日龄时极显著高于27胚龄(出雏前)(P＜0.01).胸肌中PPP3CA mRNA在21胚龄时显著低于其他各胚龄或日龄(P＜0.01);腿肌中PPP3CA mRNA在21胚龄时表达量较高,27胚龄时降到最低,且极显著低于其他各胚龄或日龄(P＜0.01).相关性分析结果显示,两鸭品种腿肌PPP3CA mRNA表达量与本研究前期检测的肌纤维类型、直径、面积和密度等肌纤维特性呈现不同程度的线性相关;两鸭品种胸肌和腿肌PPP3CA mRNA表达量与均与本研究前期检测的类胰岛素生长因子(insulin-like grow factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)mRNA表达量呈显著的正相关(P＜0.05或P＜0.01).初步推测鸭发育早期骨骼肌中PPP3与肌纤维类型和肌纤维生长发育密切相关,与IGF-Ⅰ可能共同参与了对骨骼肌生长发育的调节.本研究结果将有助于了解PPP3在鸭肌肉早期发育中的作用,并为改良鸭肉品质提供理论依据.     

转柽柳金属硫蛋白基因（MT1）烟草的获得及对重金属镉的抗性分析

将柽柳（Tamarix. sp）金属硫蛋白基因（MT1）插入到植物表达载体pBI121，利用农杆菌（Agrobactrium tumefaciens）介导法将MT1导入烟草基因组。对转基因T1植株的卡那霉素抗性分析表明，多数转基因植株后代表现为3:1的分离比例，只有少数转基因植株的抗性分离表现为15:1或不符合孟德尔遗传的分离比例。说明整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源MT1基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。转基因植株对重金属镉的抗性比对照显著提高，表现为转基因植株的株高和鲜重均明显优于非转基因株系。