瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞脂代谢和胚胎植入关键基因表达的影响

本研究旨在探究瘦素对绵羊子宫内膜上皮细胞中脂代谢过程和胚胎植入关键基因表达的影响。在发情期采集成年健康绵羊的子宫内膜上皮组织，利用组织块法培养、胰酶差时消化法纯化及角蛋白鉴定分离绵羊子宫内膜上皮细胞。经浓度筛选后，选取最适瘦素浓度250μg/mL处理绵羊子宫内膜上皮细胞，并进行脂滴检测，采用RT-qPCR法检测瘦素对胚胎植入关键基因的影响。结果显示：在250μg/mL瘦素处理下，子宫内膜上皮细胞增殖能力提升，出现脂滴聚集现象，脂代谢相关因子脂肪细胞脂肪酸结合蛋白基因表达升高（P<0.05），过氧化物酶增殖激活受体γ基因表达升高（P<0.05）；胚胎植入相关因子白血病抑制因子基因表达升高（P<0.05），整合蛋白β-3(P<0.01)、白介素-6(P<0.05)基因表达降低。本研究结果表明，250μg/mL的瘦素处理绵羊子宫内膜上皮细胞后会显著增强其细胞增殖能力，对细胞的脂代谢有显著的上调作用，对绵羊胚胎植入关键基因有显著影响，提示瘦素在绵羊胚胎附植过程中通过影响脂代谢进程影响胚胎附植过程。     

脂多糖对胚胎附植期Toll样受体4及相关免疫因子的影响

试验旨在探讨脂多糖（LPS）对绵羊胚胎附植期Toll样受体4（TLR4）及相关免疫因子表达的影响。以构建好的pcDNA3.1-TLR4过表达载体转染绵羊子宫内膜基质细胞,运用Western blotting技术鉴定细胞转染效果,然后用1 μg/L LPS刺激转染后的子宫内膜基质细胞,建立内膜基质细胞炎症模型。将经LPS处理的细胞分别培养12、24、48、72 h,采用实时荧光定量PCR技术和Western blotting法检测内膜基质细胞中TLR4 mRNA及蛋白表达量,以及免疫因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平,并以未经LPS处理的细胞作为对照。结果显示,与对照组相比,LPS促进了免疫因子IL-1β、IL-6的释放量,但随LPS作用时间的延长,细胞中IL-6的表达量逐渐下降,而IL-1β的表达量逐渐升高,使得Th1/Th2偏向不利于妊娠的Th1方向表达;TLR4 mRNA相对表达量在12、24、72 h均显著高于对照组（P<0.05）,48 h时极显著高于对照组（P<0.01）,且LPS处理后的细胞TLR4蛋白表达量也始终高于对照组。综上所述,pcDNA3.1-TLR4过表达载体成功转入绵羊子宫内膜基质细胞;LPS有效激活了子宫内膜细胞中TLR4信号通路,并促进了下游因子的表达;子宫蜕膜组织中TLR4受体蛋白对胚胎附植早期妊娠微环境的平衡维持也起到了重要作用。     

猪胚胎附植部分因子研究进展

产仔数性状是养猪业中一个重要的经济性状,而胚胎附植对猪产仔数的高低有重要的影响。胚胎附植的调控涉及到多个生物学过程,在其中发挥作用的物质（附植因子）很多。作者针对孕酮、孕酮受体、雌二醇、雌激素受体α（ESR1）和促红细胞生成素产生肝细胞受体配体（Eph-ephrin）系统这几种附植因子的相关研究进行了归纳总结,重点阐述了这些因子在母胎对话过程中的时空表达、功能、突变、调控等方面的研究进展。其中,孕酮及其受体在猪胚胎附植活动中全程发挥着重要作用,黄体分泌的孕酮与母猪子宫内膜腔上皮、腺上皮、基质和肌细胞中的孕酮受体结合发挥作用,使这些组织细胞分泌多种附植因子,这些附植因子进一步参与胚胎附植过程。雌二醇是雌激素中含量最多、活性最强的一种激素,主要由卵巢颗粒细胞分泌,雌激素受体α是子宫内雌二醇的主要受体,二者结合可使母猪发情;此外,附植中处于游离状态的胚泡也分泌雌二醇,其是一个让母猪子宫内膜得以识别的信号,允许胚泡附植。Eph-ephrin系统作用广泛,其在人、小鼠和猪的胚胎附植过程中发挥着重要作用。系统中的EphA1、ephrin A1、EphA4等基因在猪的胚胎附植期表达量显著高于空怀猪,它们在子宫内膜附植点的表达量显著高于附植点间的部位,且ephrin A1的抑制表达会降低子宫内膜上皮细胞的迁移和黏附能力。这些附植因子都在猪胚胎附植活动中发挥着重要作用,对它们的深入研究将有利于明确猪胚胎附植调控机理,进一步揭示猪高繁机理。     

细胞因子在猪胚胎附植期的作用及机制

猪胚胎的附植是通过广泛的细胞运动和重塑发生。胚胎的成功附植主要取决于胚胎延伸和滋养外胚层与子宫内膜上皮紧密连接的成功，这种紧密连接保证了孕体摄取其存活所必需的子宫腺上皮分泌物质。这些过程需要子宫和胚胎来源的细胞因子完成子宫内膜和滋养外胚层之间的细胞重塑，营造胚胎附植时的促炎微环境，维持附植阶段免疫系统的平衡，协调子宫和胚胎之间的相互作用等。本文主要综述了猪胚胎附植时期，由子宫和胚胎来源的细胞因子包括白细胞介素-1β(IL-1β)、干扰素（IFN）、成纤维细胞生长因子（FGF）、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)发挥的作用及其作用机理，以期为胚胎附植及发育调控相关研究提供参考。     

脂多糖对胚胎附植期Toll样受体4及相关免疫因子的影响

试验旨在探讨脂多糖(LPS)对绵羊胚胎附植期Toll样受体4(TLR4)及相关免疫因子表达的影响。以构建好的pcDNA3.1-TLR4过表达载体转染绵羊子宫内膜基质细胞,运用Western blotting技术鉴定细胞转染效果,然后用1μg/L LPS刺激转染后的子宫内膜基质细胞,建立内膜基质细胞炎症模型。将经LPS处理的细胞分别培养12、24、48、72h,采用实时荧光定量PCR技术和Western blotting法检测内膜基质细胞中TLR4mRNA及蛋白表达量,以及免疫因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平,并以未经LPS处理的细胞作为对照。结果显示,与对照组相比,LPS促进了免疫因子IL-1β、IL-6的释放量,但随LPS作用时间的延长,细胞中IL-6的表达量逐渐下降,而IL-1β的表达量逐渐升高,使得Th1/Th2偏向不利于妊娠的Th1方向表达;TLR4mRNA相对表达量在12、24、72h均显著高于对照组(P0.05),48h时极显著高于对照组(P0.01),且LPS处理后的细胞TLR4蛋白表达量也始终高于对照组。综上所述,pcDNA3.1-TLR4过表达载体成功转入绵羊子宫内膜基质细胞;LPS有效激活了子宫内膜细胞中TLR4信号通路,并促进了下游因子的表达;子宫蜕膜组织中TLR4受体蛋白对胚胎附植早期妊娠微环境的平衡维持也起到了重要作用。     

绵羊胚胎附植过程中相关因素的研究

胚胎附植属于哺乳动物重要的生殖生理过程,是妊娠建立的标志和重要环节。早期胚胎发育、母体妊娠识别、胚胎附植和妊娠维持都严格依赖于母—胎间复杂的信号传导及关联。大量研究证明,在绵羊胚胎附植过程中,来源于胚胎、母体子宫及宫外组织的多种生殖激素、粘附分子、细胞外基质、细胞活素物质和生长因子均可通过期间精密的调控关系参与并维持孕体的发育、子宫内膜的重塑、分泌功能及子宫生长。这对胚胎附植分子调控信号的掌握以及引起妊娠失败因素的诊断确定提供了参考,从而可提高家畜和人类的妊娠率。本文就绵羊胚胎附植迁移的过程及影响附植的相关因素进行了综述。     

猪胚胎附植部分因子研究进展

产仔数性状是养猪业中一个重要的经济性状,而胚胎附植对猪产仔数的高低有重要的影响。胚胎附植的调控涉及到多个生物学过程,在其中发挥作用的物质(附植因子)很多。作者针对孕酮、孕酮受体、雌二醇、雌激素受体α(ESR1)和促红细胞生成素产生肝细胞受体配体(Eph-ephrin)系统这几种附植因子的相关研究进行了归纳总结,重点阐述了这些因子在母胎对话过程中的时空表达、功能、突变、调控等方面的研究进展。其中,孕酮及其受体在猪胚胎附植活动中全程发挥着重要作用,黄体分泌的孕酮与母猪子宫内膜腔上皮、腺上皮、基质和肌细胞中的孕酮受体结合发挥作用,使这些组织细胞分泌多种附植因子,这些附植因子进一步参与胚胎附植过程。雌二醇是雌激素中含量最多、活性最强的一种激素,主要由卵巢颗粒细胞分泌,雌激素受体α是子宫内雌二醇的主要受体,二者结合可使母猪发情;此外,附植中处于游离状态的胚泡也分泌雌二醇,其是一个让母猪子宫内膜得以识别的信号,允许胚泡附植。Eph-ephrin系统作用广泛,其在人、小鼠和猪的胚胎附植过程中发挥着重要作用。系统中的EphA1、ephrin A1、EphA4等基因在猪的胚胎附植期表达量显著高于空怀猪,它们在子宫内膜附植点的表达量显著高于附植点间的部位,且ephrin A1的抑制表达会降低子宫内膜上皮细胞的迁移和黏附能力。这些附植因子都在猪胚胎附植活动中发挥着重要作用,对它们的深入研究将有利于明确猪胚胎附植调控机理,进一步揭示猪高繁机理。     

绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞的分离与鉴定

为了有效分离纯化绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞,为绵羊早期胚胎附植相关研究提供可靠的体外细胞模型,本试验采用组织块培养法分离培养子宫内膜上皮和基质细胞,利用胰酶差时消化法对2种细胞进行纯化,通过免疫荧光法对上皮细胞和基质细胞的特异性表达蛋白角蛋白18(CK18)和波形蛋白分别进行鉴定。结果显示,利用组织块法第3天开始有细胞从组织块中爬出,5～6 d单层细胞铺开,显微镜下观察细胞形态呈梭形和铺路石状,2种细胞交织在一起生长。使用0.25%胰蛋白酶消化细胞时,基质细胞约90 s变圆有脱落,而上皮细胞则需要6 min变圆有脱落。免疫荧光鉴定结果显示上皮细胞呈角蛋白阳性,波形蛋白染色阴性,阳性率大于95%。基质细胞呈波形蛋白阳性,角蛋白阴性,阳性率大于95%。研究结果表明,采用组织块培养法结合胰酶差时消化法可成功分离得到纯度较高的绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞,为绵羊胚胎附植过程中子宫内膜细胞的相关生物学功能研究奠定基础。     

猪PPARs基因在胚胎附植期子宫内膜表达特性研究

过氧化物酶体增殖物活化受体(PPARs)的表达及其功能的调控,可能在维持妊娠或诱发分娩的机制中产生作用。本研究利用免疫组化法,对PPARα、β/δ和γ基因在妊娠第12天、18天及第25天母猪的子宫内膜组织表达特点进行研究。结果表明:在胚胎附植早期,PPARβ在多数细胞中均有表达,且以绒毛膜滋养层细胞表达最强;而PPARα和γ则主要表达于腔上皮和腺上皮及子宫内膜外层组织细胞,但表达不强且多数无分布规律性。在附植中期,3种亚型的表达强弱差别不大,且主要呈无规律性分布;但在附植晚期,PPARβ的表达明显减弱且在绒毛膜细胞滋养层、合胞体滋养层、基质以及子宫腔上皮细胞中无表达,然而PPARβ和γ却仍表达于多种细胞中。可见,PPARβ与胚胎附植的初期、PPARα和γ与胚胎附植的中后期很可能密切相关。     

SV40T基因对绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外增殖的影响

本研究旨在通过SV40T基因导入来提高绵羊的子宫内膜上皮细胞(EECs)和基质细胞(ESCs)的体外传代次数,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究奠定基础。采用酶促分离获得原代绵羊EECs和ESCs,并用携带SV40T基因的慢病毒以MOI 1:10和MOI 1:50感染并进行单克隆细胞株筛选。结果表明,所得EECs和ESCs分别具有上皮和基质细胞典型特征(上皮细胞呈铺路石状,基质细胞呈梭形)并表达特异性标记蛋白细胞角蛋白(Cytokeratin)和波形蛋白(Vimentin);EECs传至约50代,ESCs传至约30代后,光学形态观察、SV40T基因表达、标记蛋白免疫荧光及血清依赖性检测结果表明两类细胞形态未发生变化,均表达SV40T基因,并具有上皮细胞特性和基质细胞特性,伴有较强的血清依赖性,证实成功建立了EECs和ESCs细胞株;生长曲线和SV40T基因拷贝数检测结果显示ESCs的增殖能力要强于EECs,MOI 1:10和MOI 1:50感染下,SV40T基因拷贝数差异不显著。以上结果提示,SV40T基因能够大大增强绵羊EECs和ESCs体外增殖能力并延长其寿命,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究提供了素材。     

马胚胎附植及其分子调控研究进展

胚胎附植是处于活化状态的囊胚滋养层细胞与处于接受态的母体子宫上皮细胞之间逐步建立组织和生理上联系的过程。马（马属动物）在该过程中先后存在侵入性的绒毛膜带（子宫内膜杯）和非侵入性的尿囊绒毛膜（微子叶型上皮绒毛膜胎盘）,是一种集侵入性与非侵入性胚胎滋养层于一体的哺乳动物。多种分子共同调节妊娠母马的胚胎附植过程。作者综述了马胚胎附植特点、过程与相关分子调控的研究进展,对减少母马妊娠早期胚胎丢失与流产具有重要参考价值。     

CsA对LPS诱导的子宫内膜基质细胞中IL-1β和IL-6表达的影响

本研究旨在探索免疫抑制剂环孢菌素A（CsA）对LPS诱导的子宫内膜基质细胞中促炎症细胞因子白细胞介素1β（IL-1β）和白细胞介素6（IL-6）表达的影响。母兔子宫内膜基质细胞经过体外培养和鉴定后,用1 μg/mL脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导构建子宫内膜基质细胞炎症模型,0 μg/mL LPS处理作对照组。用0、50、100、200和500 ng/mL CsA处理后,分别检测IL-1β和IL-6的表达水平。结果显示,与对照组相比,添加LPS显著诱导IL-1β和IL-6在子宫内膜基质细胞中的表达（P<0.05）,CsA对子宫内膜基质细胞IL-1β和IL-6的表达无影响,但50、100、200和500 ng/mL CsA均极显著地抑制1 μg/mL LPS诱导的IL-1β和IL-6表达的上调（P<0.01）。因此,在子宫内膜基质细胞中,一定剂量的CsA能够有效抑制LPS诱导的子宫内膜基质细胞的免疫应激。本研究为雌性生殖道遭受革兰氏阴性菌感染引起免疫应激后用CsA治疗的可行性提供了依据,但在临床上的应用及其机制尚需进行深入研究。     

哺乳动物胚胎附植与中药保胎作用机制研究进展

附植是指哺乳动物囊胚滋养层细胞与母体子宫上皮细胞之间逐步建立组织生理上联系的过程。成功的附植有赖于胚泡与母体相互识别,胚泡发育与母体子宫变化的同步以及抑制母体的免疫排斥反应和母体接受性等一系列事件。这些事件又受到母体和胚泡的激素以及一些因子的调控。传统中药可通过提高孕酮的含量、类雌激素样作用、治疗子宫内膜炎的作用以及影响白血病抑制因子和白细胞介素1的表达量来促进山羊胚胎附植。文章主要论述了哺乳动物胚胎附植的机制以及中药对胚胎附植的影响,这有助于进一步阐明中药保胎的作用机理。     

ephrin A1基因在附植后期猪繁殖组织表达变化及与表观性状的关联分析

本研究旨在明确促红细胞生成素产生肝细胞配体A1(ephrin A1)在猪附植后期的mRNA和蛋白表达规律,分析高胚胎数母猪和低胚胎数母猪之间表达差异,以及这些差异与繁殖性状的关系。选择妊娠第22天和24天(附植后期)母猪,屠宰后采集6种繁殖组织样,利用Real-time定量PCR(qPCR)和免疫印迹方法检测这些组织样品中ephrin A1基因的mRNA和蛋白表达量,并将基因表达量与繁殖性状进行关联分析。妊娠第22天,高胚猪和低胚猪的黄体数和总胚胎数均差异显著(P0.05)。Real-time qPCR结果显示:妊娠第22天,子宫内膜附植点的表达量显著高于尿囊绒毛膜或胚胎(P0.05),高胚猪的胚胎表达量小于低胚猪(P0.05);妊娠第24天,ephrin A1在组织中的mRNA表达量由高到低依次为:子宫内膜附植点、子宫内膜附植点间、子宫颈、卵巢黄体和胚胎;妊娠第22天或24天,妊娠猪ephrin A1的mRNA表达量均高于空怀猪(P0.05)。Western blot结果显示,妊娠第24天,ephrin A1蛋白在子宫内膜附植点的表达量最高,其次为子宫内膜附植点间和卵巢黄体(P0.05)。ephrin A1的表达与胚胎长度呈正相关,相关系数为0.31～0.59;相较于胚胎重、总胚胎数、正常胚胎数和卵巢重性状,ephrin A1表达与胚胎长度之间出现最高相关系数。研究结果表明,ephrin A1表达在猪附植后期的调控过程中可能发挥重要作用,子宫内膜附着位点可能是ephrin A1基因表达的主要靶组织,ephrin A1的表达量增加可能与胚胎生长(长度和重量)和卵巢重量增加有关。     

绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞培养方法的建立

为建立一种经济、简便的分离纯化培养绵羊子宫内膜上皮细胞及基质细胞的方法,采用传统组织块培养法、胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶消化+组织块培养法,分别对绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞进行了原代培养比较研究。结果表明:3种方法均可以获得原代绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞。混合生长的细胞经胰蛋白酶差时消化可获得较纯上皮细胞和基质细胞,且其生长曲线均呈S型。经比较分析,胰蛋白酶消化+组织块培养法为最佳培养方法,操作简便、经济实用,获得的绵羊子宫内膜上皮细胞呈铺路石状可传3代,角蛋白18免疫细胞化学染色阳性,纯度达90%以上;基质细胞呈长梭形、漩涡状生长可有限传代,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,纯度达95%以上。     

原代犬小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立原代犬小肠上皮细胞分离培养及纯化的方法,为犬肠道病毒性、细菌性及寄生虫相关疾病研究提供细胞材料。采用组织块培养法分离培养原代犬小肠上皮细胞,胰酶差速消化法进行纯化,利用细胞形态学、间接免疫荧光法鉴定上皮细胞特性,脂多糖(LPS)刺激原代上皮细胞,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测炎性因子转录水平,鉴定原代犬小肠上皮细胞的功能。结果显示：组织块培养法获得的原代犬小肠上皮细胞可在24 h内贴壁,第3天细胞开始增殖,第4天时达到增殖顶峰,第5～7天细胞活性逐渐降低,在体外连续传代可培养至第10代。经胰蛋白酶差速消化纯化后,获得铺路石样原代犬小肠上皮细胞,生长曲线类似“S”形,上皮细胞特异性细胞角蛋白18 (CK18)鉴定呈阳性,LPS可诱导犬小肠原代上皮细胞炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的转录水平在12 h(P<0.05)、24 h(P<0.01)表达量呈显著和极显著差异。研究表明,利用组织块培养法可成功分离获得数量较多、纯度较高且具有典型上皮细胞形态和功能的犬小肠上皮细...     

瘦素及其长型瘦素受体在雌性小鼠体内的表达

采用免疫组织化学SP染色法对长型瘦素受体在雌性小鼠生殖周期不同阶段的下丘脑、卵巢、子宫中细胞定位和分布进行了研究,并用ELISA方法对小鼠血清中的瘦素浓度进行了检测。结果显示,下丘脑神经元胞质中有棕褐色阳性颗粒,且阳性细胞数量随妊娠日龄增加逐渐增加,妊娠期与间情期阳性细胞数差异显著(P0.05);在卵巢中,卵母细胞胞质中有长型瘦素受体表达,随卵泡的发育,卵泡细胞中免疫反应阳性细胞数量逐渐增加;在胚泡附植期,瘦素受体在子宫腺和子宫内膜上皮细胞中大量表达。妊娠期血清瘦素浓度均高于间情期,且瘦素浓度从间情期到妊娠4日龄,呈上升趋势,妊娠5日龄稍下降,后随妊娠日龄逐渐增加。结果表明,瘦素及其长型受体能够促进卵泡发育,有利于小鼠胚泡的附植。     

TNC基因敲除对绵羊子宫内膜上皮细胞迁移的影响

本研究旨在探究TNC(Tenascin-C)基因敲除对绵羊子宫内膜上皮细胞（Endometrial Epithelial Cells,EECs）迁移功能的影响及其内在信号通路,为研究胚胎附植及改善子宫内膜容受性提供借鉴。在TNC外显子3和5设计和筛选高活性sgRNA,转染绵羊EECs后,通过PCR和RT-PCR鉴定出TNC 6.1 kb片段缺失的绵羊EECs,即plate 1-G3和plate 2-B5。通过划痕实验检测plate 1-G3和plate 2-B5迁移功能变化,并通过RNA-seq和生物信息学分析筛选共差异表达基因（co-Differentially Expressed Genes,co-DEGs）,进行GO分析、KEGG分析以及PPI分析。结果表明,TNC基因敲除促进了绵羊EECs的迁移,通过RNAseq和生物信息学分析筛选出2326个co-DEGs,包括1304个上调co-DEGs和1022个下调co-DEGs。GO分析显示,co-DEGs富集到细胞迁移、粘附、细胞-底物连接等。KEGG分析显示,co-DEGs富集在PI3KAkt信号通路、ECM-受体相互作用、Rap...     

长链非编码RNA在哺乳动物胚胎附植中的作用研究进展

胚胎附植是一个复杂的生物过程，在哺乳动物的妊娠环节中至关重要，其发生受到很多转录调控因子的影响。长链非编码RNA(Long Non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200核苷酸（nt）的转录本，基本不编码蛋白质，但其参与胚胎发育、肌肉发育、性别决定与分化等多种生物学过程和疾病的调控。本文简述lncRNA的研究现状，主要介绍了lncRNA通过影响子宫内膜容受性、调节蜕膜、调节子宫内膜增殖、调节激素水平等途径促进胚胎附植，以期为哺乳动物胚胎附植期中lncRNA的功能研究提供参考。     

不同性腺激素水平对子宫内膜细胞体外增殖的影响

为探讨不同雌激素（E2）和孕激素（P4）水平对家兔子宫内膜细胞体外增殖和分化的影响。采用离心法获取家兔子宫内膜上皮细胞及基质细胞，设不同雌激素和孕激素水平组合添加于培养液，利用MTT法间接测定不同性腺激素水平对子宫上皮和基质细胞的体外增殖的影响；利用免疫组织化学法检测传代细胞是否分化为其他类型细胞。结果表明利用离心法可获得纯度较高的子宫内膜上皮和基质细胞；孕激素（100nmol／L）对基质细胞的增殖有促进作用（P〈0.05），雌激素（100nmol／L）和少量孕激素（10nmol／L）对上皮细胞增殖有促进作用（P〈0.05）；免疫组化结果表明，经性腺激素刺激的子宫内膜上皮和基质细胞分别对上皮角蛋白抗体和波形蛋白抗体呈阳性。研究证实适宜的性腺激素水平对体外培养的子宫内膜细胞有促进增殖的作用，而且不会促使其分化为其他类型细胞。