龙眼APETALA1(AP1)同源基因的克隆与序列分析

根据植物APETALA1(AP1)同源基因的高度保守性,设计合成一对特异引物,从龙眼基因组DNA中扩增出一条长400bp左右的基因片段,插入到pMD-T载体中。测序后分析表明,扩增得到了龙眼AP1同源基因片段。该片段序列包含两个内含子(长96bp和165bp),编码区编码36个氨基酸。与其它植物AP1同源基因的相应区域氨基酸序列具有较高的同源性,其中与花椰菜AP1基因同源性高达91%,与欧亚种葡萄、苹果、柑橘、枇杷的AP1基因同源性都在80%以上。     

苹果LEAFY同源基因的cDNA克隆与表达分析

 从苹果的果台枝顶芽中克隆了两个长约1.4 kb的cDNA片段，分别定名为AFL1和AFL2。它们的碱基序列在编码区有90%的同源性，但在3’末端非编码区仅有约印％的同源性。它们表达的肽链氨基酸序列与小叶杨、大豆、矮牵牛等有70％以上的同源性，与番茄、金鱼草、拟南芥有近70%的同源性，证明它们是LFY的同源基因。RT-PCR的结果表明，生长期AFL2在萼片、子房、根、茎、叶以及果台枝顶芽中都有表达，而AFL1只在果台枝顶芽中表达；在不同发育时期的果台枝顶芽中，AFL1在顶芽停止营养生长转向生殖生长以后才清晰表达，而AFL2在生长期6~10月都有表达。因此认为苹果中的这两个LFY同源基因虽有共同的起源，但是在功能上存在差异，在花和营养组织的发育中起不同的作用。DNA印迹分析表明，在苹果属及近缘的梨属植物中LFY同源基因是多拷贝的。     

杧果MiLCYB2基因启动子的克隆与序列分析

【目的】了解杧果Mi LCYB2基因的表达调控规律。【方法】应用染色体步移方法克隆了991 bp的Mi LCYB2基因启动子序列。【结果】用在线软件Plant CARE分析表明,该序列除含有启动子基本元件,如TATA-BOX、CAAT-BOX外,还含有ABA、GA、Auxin、SA、Me JA多种植物激素响应元件,以及参与生理周期调控、MYBHv1结合位点和光响应元件等一些其他的调控序列,推测Mi LCYB2基因的表达受多种植物激素、光照、生理周期、MYBHv1转录因子等的调控。【结论】杧果Mi LCYB2基因启动子的分离与序列分析为进一步探究杧果类胡萝卜素基因的调控机制提供了新的理论基础。     

西瓜抗病基因同源序列的克隆与分析

以植物丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶类（STK）抗病基因产物催化结构域l的保守氨基酸序列设计简并引物,以西瓜基因组DNA为模板进行PCR,扩增,得到大约500bp的目的条带。重组质粒经PCPo检测后进行测序,获得1个有效序列,可以编码完整的氨基酸序列。同源性分析表明其具有STK保守结构域,与已经克隆的Pto、LrlO和Lectin等基因在氨基酸水平上的同源性为40．O％～54．O％。     

果树R基因同源序列克隆的初步研究

用2对根据已知植物抗病基因(R基因)编码的蛋白质的NBS保守区而设计的特异简并引物,对荔枝、龙眼、芦柑、柚子及银杏的基因组DNA进行体外扩增.其中一对引物(P1/P2)在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中获得的扩增产物均表现为一条大小约500bp的明亮谱带,而银杏扩增产物的亮带则在约750bp处,且弥散在400 ～ 1000bp之间.另一对引物在荔枝、龙眼、芦柑和柚子中没有特异扩增带,而在银杏中获得了一条400 ～ 600bp的较亮的宽带.将荔枝、龙眼、芦柑和柚子的500bp特异扩增带以及银杏的400 ～ 600bp条带回收克隆,并分别筛选几类阳性克隆进行测序.共获得15个片段的序列.经比较发现,来自荔枝、龙眼、芦柑和柚子的12个片段均属于NBS-LRR类抗病基因同源序列(RGA),与已知R基因相应区段的氨基酸序列的一致性为15.5% ～ 47.1%;而3个来自银杏的片段均不是RGA,其中1个与反转录酶有较高的同源性,另2个在GeneBank中没有找到同源序列.该结果显示,应用同源扩增技术克隆果树RGA是可行的,但银杏作为古老的裸子植物,其抗病基因的结构与现代物种可能有很大差异.     

茶树LEAFY基因的克隆和表达分析

以茶树（Camellia sinensis）大叶且无蕾不开花的突变体‘大叶龙’及其母株为材料,通过同源克隆结合RACE-PCR方法,克隆了LEAFY（LFY）同源基因的全长cDNA序列,两种序列分别命名为CsLFL1和CsLFL2,其cDNA全长分别为1 448和1 466 bp,各自包含1 191和1 197 bp的完整开放阅读框,编码396和398个氨基酸。它们与漆树科、无患子科以及壳斗目（山毛榉目）一些物种的LFY同源序列具有77% ~ 79%的一致性,具有植物LFY成员作为转录因子的脯氨酸富集区、亮氨酸重复、酸性和碱性结构域以及保守的C–端等典型结构特征。系统发育分析表明,它们属于双子叶植物LEAFY分支,并且亲缘关系最近,说明两者的形成是发生在茶树物种进化过程中较晚期的复制事件。两种序列在正常开花母株及‘大叶龙’中没有区别,在母株花芽中强烈表达,在母株和‘大叶龙’叶芽中有微弱表达。这些结果说明CsLFL1和CsLFL2代表了茶树中LFY的同源基因,并且可能参与茶树的成花启动过程。     

龙眼梅PGIP基因的克隆及序列分析

利用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)得到在龙眼梅(PrunusmumeSiebetZucc.Longyan)嫩芽中特异性表达的PGIP基因。DNA序列分析表明,所获得龙眼梅的PGIPcDNA的序列全长为1045bp,该序列与已发表的PGIP基因有很高的同源性。     

菠菜NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析

依据已知NBS-LRR类抗病基因的P-loop和GLPL两个保守结构域设计简并引物,对抗菠菜霜霉病商业杂交种RZ51-147、自交系12S3和12S4的基因组DNA进行PCR扩增、克隆和序列测定,共获得23条具有完整开放阅读框且含有NBS结构的抗病基因同源序列(resistancegeneanalogs,RGAs),编号为SP1~SP17、SP19~SP24,其在NCBI中的登录号为KX914865~KX914887。核苷酸比较分析结果表明,这23条RGAs大多与甜菜中推测的一些抗病蛋白基因或其他相关蛋白基因具有较高的同源性,其中SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12、SP13等8条序列均与甜菜RF45类抗病蛋白有着86%以上的同源性;SP3、SP4、SP8、SP9、SP24等5条序列与甜菜RPP13类抗病蛋白的同源性在85%以上,与向日葵抗霜霉病基因PI8相应区域的氨基酸序列相似性为32.20%~33.52%,且在进化树上聚为一类,推测其可能与抗霜霉病相关。同源进化分析结果表明,除SP7外,其余序列均为non-TIR-NBS-LRR类抗病基因,并与推导的氨基酸序列多重比较结果一致。     

柑桔LEAFY同源基因片段分离及特性研究

 根据不同植物LEAFY ( LFY) 同源基因3’端序列高度保守性, 设计合成简并引物, 采用PCR 技术首次从柑桔基因组DNA 中分离出一条长883 bp 的柑桔LFY 同源基因( csLFY) 片段。序列分析表明, 所扩增的883 bp DNA 片段中包含一个长476 bp 的内含子, 拼接位点与其他植物的LFY 同源基因一致。由外显子推导的氨基酸序列与其它植物LFY 同源基因的相应区域氨基酸序列同源性为77 %～97 % , 其中与烟草NFL 和矮牵牛ALF 的同源性最高, 达到97 %。RT—PCR 研究表明, csLFY 在柑桔成年结果枝上的花芽和营养芽以及童期幼苗的营养芽中均有表达, 但童期营养芽中的表达强度明显低于花芽。     

灵芝启动子同源序列的克隆及其分析

采用同源克隆法，以赤芝基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物克隆进T-载体后，进行DNA测序和分析。对获得的12条DNA序列进行核酸序列比对（BLASTn）、Proscan：version 1．7预测和Signal Scan分析，综合结果显示，LY17．1、LY19．3、LY26和LY31为可能启动子序列。其中LY17．1和LY26具有完全的启动子特征，包括核心启动子区、TATA盒、转录起始位点等。LY31与香菇gpd启动子具有98％的相似性。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

LEAFY基因植物表达载体的构建

本研究采用植物中间表达载体pBll21构建拟南芥花分生组织特性基因-LEAFY基因的植物表达载体。LEAYY基因带有植物组成型启动子-CαMV35S。该表达载体的构建为利用LEAFY基因进行木本果树遗传转化创造了条件。     

南瓜 NBS类抗病基因同源序列的克隆与分析

依据已克隆植物抗病基因的保守氨基酸结构域合成相应简并引物,通过PCR扩增从南瓜基因组DNA中分离了8条南瓜抗病基因同源序列,通过对其编码的氨基酸序列分析表明这些RGAs均含有P-loop及GLPL等植物抗病基因中的保守结构域.经BLAST分析表明,分离的南瓜RGAs与已报道的甜瓜等植物的RGAs有较高的同源性.南瓜RGA的分离将为进一步从南瓜中分离功能性抗病基因打下基础,也为研究南瓜种质资源的起源与进化提供借鉴.     

番木瓜丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因同源序列的克隆与特征分析

根据丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类抗病基因产物催化结构域Ⅰ和Ⅸ的氨基酸保守序列设计简并引物,PCR扩增番木瓜叶片基因组DNA和cDNA。在NCBI中用BlastX比对发现,5个来自基因组DNA的克隆和4个来自叶片cDNA的克隆可能编码的氨基酸残基序列属于STK蛋白激酶类抗病基因同源序列片段和受体样蛋白激酶基因的同源片段,命名为gPK1-gPK5和cPK1-cPK4,在GenBank注册得到序列号分别为AY693385-AY693389,AY738762-AY738765。除克隆gPK5含有内含子之外,其它都发现了连续阅读框ORF。通过分析除Gpk5之外的8个克隆可能编码氨基酸序列中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类蛋白激酶的9个催化保守结构域Ⅰ-Ⅸ,并利用ClustalW软件对8个克隆和已报道的抗病蛋白水稻Xa21和西红柿Pto氨基酸残基序列进行分子系统进化树分析发现,8个克隆不仅是受体样蛋白激酶基因的同源片段而且是抗病候选基因片段。     

草菇ras启动子区域的克隆及其序列分析

根据Kajiwara S等报道的ras启动子的序列设计并合成一对特异引物，以草菇菌丝的总DNA为模板，通过PCR扩增，获得一条长约0．75kb片段。DNA序列测定结果表明，该片段长度为751bp。采用Blast软件和Promoter predictions软件进行启动子序列结构分析，结果表明，该片段中243-293bp和539-589bp两区域为ras启动子的基础启动子区。在283bp和579bp处有两个转录起始位点，在244～247bp和292～295bp之间有2个TATAbox，在36～39bp、377～380bp、434-437bp和716～719bp之间有4个CAATbox。此外，该片段中还含有9个Gbox、12个Ibox、2个Pbox以及3个重要顺式作用元件：ABRE元件、WUN-motif(基元)和HSE元件。     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

番茄PG基因启动子的序列分析

以"中蔬四号"番茄为试材,利用PCR技术从"中蔬四号"番茄中扩增出1 500bp的PG基因启动子,并对启动子序列进行了生物信息学分析。结合PLANTCARE和PLACE数据库Database预测分析PG启动子。结果表明:PG启动子具有多个典型的TATA-Box和CAATBox等基本元件,以及光响应元件、热响应元件、乙烯响应元件、植物组织特异调控元件、胚乳表达相关调控元件、逆境胁迫响应元件、生理昼夜节律控制元件等,说明番茄PG基因的表达与光、温度、激素、逆境等因素有关,为以后深入研究PG基因的调控等研究提供理论基础。     

桂花SVP同源基因的克隆及序列分析

试验以桂花‘日香桂'Osmanthus fragrans cv.rixianggui嫩叶为试验材料,根据转录组数据库中SVP基因的保守序列信息,通过PCR方法克隆得到日香桂SVP基因,将其命名为QfSVP,运用在线生物信息学分析工具对OfSVP序列进行分析。结果表明:OfSVP基因全长1325bp,开放阅读框(ORF)为687bp,编码228个氨基酸。氨基酸序列保守性分析发现,OfSVP所编码的蛋白中含有MADS-box基因家族特有的K-box区域。通过ProtParam ExPASy在线软件分析OfSVP蛋白质分子式为C1121H1859N327O364S9,分子量为26030.60Da,理论等电点PI值为5.80。不稳定指数为68.10,属于不稳定蛋白质。蛋白氨基酸序列比对和系统发育进化分析结果表明OfSVP与油橄榄(Olea europaea)、黄连(Coptis chinensis)和芝麻(Sesamum indicum)的同源性分别达到94%、83%和82%;OfSVP基因的克隆与序列分析对于进一步了解桂花'日香桂'成花机理具有重要意义。     

黄瓜CsPAP-fib基因的克隆与序列分析

以温敏型黄瓜‘C09-123’为试材,通过对不同夜温处理的黄瓜幼叶进行差异蛋白质鉴定,筛选出一个与低夜温影响黄瓜雌性形成密切相关的蛋白,采用生物信息学方法,对该蛋白进行生物信息学分析,并运用基因克隆技术克隆了该基因,以期为明确该基因在黄瓜性别分化中的作用机制奠定基础,也为进一步试验研究提供基因材料。结果表明:该基因全长870bp,编码289个氨基酸,该基因编码的蛋白质属于叶绿体中一个不稳定的疏水蛋白质,无明显信号肽,无跨膜结构。与甜瓜为同一进化分支,同源性较高。该蛋白属于PAPfibrillin蛋白家族,因此将编码该蛋白的基因命名为CsPAP-fib。     

沙田柚RNase-like基因的克隆及序列分析

以沙田柚自交和异交花柱为试材,采用高通量测序技术对其进行转录组测序。通过差异分析得到RNase-like贮藏蛋白的基因序列,并研究了其理化性质。结果表明:该基因全长1 048bp(GenBank登录号为KR363153),开放阅读框(ORF)全长为693bp,共编码230个氨基酸,编码的蛋白质的分子量为25.82kDa,理论等电点为5.30,含有核苷酸结合的保守区域,属于RNase-T2超家族成员。该蛋白为疏水性蛋白,可能的磷酸化位点共有15个。氨基酸序列同源性分析表明,该基因编码的氨基酸与甜橙和克莱门柚的同源性均为99%。系统进化树显示沙田柚RNase-like贮藏蛋白基因与甜橙,克莱门柚的亲缘关系较近,属于同一进化分支。