重组金黄色葡萄球菌FnbpA亚单位疫苗的研制

【目的】制备金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白A(FnbpA)基因工程亚单位疫苗,并以小白鼠为试验模型,检测其免疫保护效果。【方法】诱导表达FnbpA,经组氨酸标签亲合纯化后用Bradford法测定纯化的目的蛋白的含量,并检测其黏附活性及对动物的安全性。制备FnbpA亚单位疫苗,经无菌检验及安全检验后,进行免疫保护试验,用ELISA方法检测被免疫小鼠血清中的抗体效价,通过腹腔攻毒试验检测疫苗的免疫保护力。【结果】纯化的目的蛋白在80 ku处出现单一条带,蛋白质量浓度为0.245 mg/mL。细菌黏附抑制试验发现,经FnbpA蛋白预处理过的MDBK细胞黏附的金黄色葡萄球菌数较对照极显著减少;动物安全性试验显示,小鼠注射FnbpA亚单位疫苗后均健活,表明制备的FnbpA亚单位疫苗安全性良好。所有免疫组小鼠于首免后7 d即可在血清中检测到特异性抗体,抗体效价逐渐上升,在21 d达到最高值,之后逐渐降低。【结论】纯化的FnbpA蛋白达到了电泳级纯度,且依然保持良好的黏附活性;制备的FnbpA亚单位疫苗作用机体产生的抗体水平符合抗体消长规律,且表现出良好的免疫保护力。     

hAPOB的克隆、原核表达及抗体效价分析

【目的】人载脂蛋白B(hAPOB)是保持人体血脂恒定的重要蛋白,检测hAPOB具有重要的临床价值。【方法】本研究将hAPOB(97-526AA)序列连接到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-hAPOB(97-526AA)原核表达质粒,然后将其转入宿主菌BL21,宿主菌表达出与预期分子量大小相符的80 kDa的融合蛋白;将纯化后的融合蛋白免疫湖羊,制备抗hAPOB血清并检测抗体效价。【结果】每次注射0.4 mg的原核表达抗原,湖羊抗血清的产生效果最佳;经间接酶联免疫分析(ID-ELISA)方法检测,原核表达蛋白免疫湖羊得到的hAPOB抗体效价为l︰40000。【结论】本试验获的抗血清能够满足商用标准,为后续拓展其应用奠定了基础。     

苦马豆素-HSA对小鼠免疫原性研究

【目的】研究苦马豆素-HSA(SW-HSA)对小鼠的免疫原性,为构建SW噬菌体单链抗体库奠定基础。【方法】将12只健康Balb/c小鼠随机分为小剂量免疫组(A组)、大剂量免疫组(B组)和对照组(C组)3组,每组4只。免疫组用SW-HSA加入佐剂后进行了4次免疫,首免和第2次免疫间隔30 d,抗原剂量相同,分别为A组0.05mg/只,B组0.10 mg/只;第3,4次免疫分别在第50,70天进行,第3次免疫各组抗原量分别是首免的1.5倍,第4次免疫抗原量分别是首免的2.5倍。第3,4次免疫后第10天采血,用间接血凝试验与间接酶联免疫吸附试验检测血清中的SW抗体效价。【结果】第4次免疫后,间接血凝试验检测显示,A、B两组小鼠血清中的抗体效价分别达26和25;间接酶联免疫吸附试验检测显示,A、B两组小鼠血清中的抗体效价分别达29和28。【结论】用SW-HSA免疫Balb/c小鼠,可获得高抗体效价的免疫小鼠。     

利用PRNP-/-羊制备朊蛋白多克隆抗体及其特性分析

【目的】利用朊蛋白双基因敲除（PRNP-/-）羊制备朊蛋白多克隆抗体,并对其特性进行分析。【方法】构建山羊朊蛋白（PrP）原核表达载体,转入大肠杆菌并诱导表达,纯化获得羊PrP;将获得的PrP免疫PRNP-/-山羊,制备朊蛋白特异性的多克隆抗体;并对获得的朊蛋白多克隆抗体进行ELISA及Western-blot检测。【结果】获得了大量的朊蛋白特异性抗血清,间接ELASA检测抗血清中朊蛋白多克隆抗体的效价为25600;Western-blot检测显示所制备抗体不仅可以识别鼠、牛、羊脑组织内源性朊蛋白,而且能识别鼠脑组织内朊病毒。【结论】PRNP-/-转基因山羊可用于制备大量高亲和力朊蛋白多克隆抗体,获得的抗体可用于多种动物朊蛋白及朊病毒类疾病的检测。     

大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白多克隆抗体的制备与应用

【目的】制备大口黑鲈蛙虹彩病毒主衣壳(MCP)蛋白兔多克隆抗体,以期为该病毒蛋白功能研究奠定基础。【方法】对pET32a(+)MCP/BL21重组大肠杆菌进行诱导表达,将重组蛋白进行纯化、复性,以此为抗原免疫大耳兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,间接免疫荧光试验（IFA）和Western Blot 法分析MCP多克隆抗体的特异性。【结果】纯化的MCP重组蛋白条带特异;间接ELISA结果显示,制备的兔多克隆抗体血清效价为1∶1 024 000;IFA和Western Blot检测结果表明该多抗特异性良好,能够与大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白发生特异性反应,IFA试验表明血清最适稀释度为1∶500。【结论】成功制备了大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP兔多克隆抗体,该抗体可特异性识别大口黑鲈蛙虹彩病毒MCP蛋白。     

猪产肠毒素大肠杆菌987P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌(ETEC)987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体(IgY)的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍(214),但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

猪产肠毒素大肠杆菌_（987）P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌（ETEC）987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体（IgY）的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍（214）,但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

猪产肠毒素大肠杆菌987P菌毛卵黄抗体的研究

【目的】探索产肠毒素大肠杆菌（ETEC）987P菌株培养的最佳条件及987P菌毛诱发蛋鸡制备卵黄抗体（IgY）的最佳免疫程序,为IgY的工业化、规模化生产提供参考。【方法】扩大培养987P菌株,抽提层析纯化987P菌毛蛋白,然后以其为抗原免疫20周龄开产海兰蛋鸡,采用间接ELISA检测987P菌毛蛋白免疫IgY效价。【结果】987P菌株的最佳培养条件为37℃下Slanctz固体培养基培养24 h;以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫20周龄开产蛋鸡,发现987P菌毛蛋白二免、三免IgY效价总体趋势基本一致,均在第3周达到峰值并维持1周,二免抗体峰值为213,三免抗体峰值是二免峰值的2倍（214）,但第4周过后三免IgY效价仍保持在213,且持续时间长,一般维持2～3周。【结论】以纯化987P菌毛蛋白为抗原免疫蛋鸡,能获得较高效价的IgY,且适当增加免疫次数能有效提高抗体水平和延长持续时间。     

副猪嗜血杆菌间接血凝诊断液的制备

【目的】建立一种便于检测副猪嗜血杆菌抗体的方法。【方法】将分离纯化的副猪嗜血杆菌5型超声裂解后,致敏双醛处理的健康绵羊红细胞,制成副猪嗜血杆菌5型间接血凝诊断液,检测该诊断液的活力及特异性。【结果】该诊断液特异性强,仅与副猪嗜血杆菌5型阳性血清发生凝集反应。活力也比较高,达到1:512以上,可以用其进行副猪嗜血杆菌疫苗免疫后抗体检测。【结论】该间接血凝诊断液成功制备为广大兽医化验人员提供一种简单、快速、经济的检测副猪嗜血杆菌抗体的方法,为副猪嗜血杆菌病的诊断和防治提供一种有效的手段     

仔猪抗E2抗体水平的调查研究

【目的】寻找一种更具针对性、更为可靠的仔猪猪瘟抗体水平检测方法。【方法】分别采用间接ELISA、间接血凝试验（IHA）,对广西某猪场的90份已超免的不同阶段仔猪血清进行抗猪瘟E2抗体和猪瘟全抗体水平监测。【结果】在间接ELISA试验中,阳性样品数为86份,占总样品比例的95．56％;间接血凝试验结果效价在1：16以上（含1：16）的血清样品为88份,占总样品比例的97．78％,两者差异不显著。【结论】仔猪血清中确实存在具有保护性的抗E2抗体,以间接ELISA检测抗E2抗体来监测猪瘟免疫水平是可行的,这为猪瘟免疫水平的监测提供了一种新方法,也为制定免疫程序提供了科学依据。     

溶葡萄球菌素的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】制备溶葡萄球菌素(lys)的多克隆抗体,为检测其在转基因细胞、胚胎及转基因动物中的表达奠定基础。【方法】以含有lys基因成熟肽序列的PEPB质粒为模板,经PCR扩增,构建pET28a-Ly原核表达载体,并以其转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导表达并纯化蛋白后,常规免疫家兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体的特异性。【结果】构建的原核表达载体pET28a-Ly经IPTG诱导6h后即可高效表达lys蛋白,蛋白经纯化后,其质量浓度可达到3.05mg/mL;抗体经ELISA检测,效价为1∶27 000,West-ern blot检测结果表明,抗体的特异性较好。【结论】成功构建了lys原核表达载体,所制备的lys多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性。     

仔猪抗E2抗体水平的调查研究

【目的】寻找一种更具针对性、更为可靠的仔猪猪瘟抗体水平检测方法。【方法】分别采用间接ELISA、间接血凝试验（IHA）,对广西某猪场的90份已超免的不同阶段仔猪血清进行抗猪瘟E2抗体和猪瘟全抗体水平监测。【结果】在间接ELISA试验中,阳性样品数为86份,占总样品比例的95.56%;间接血凝试验结果效价在1∶16以上(含1∶16)的血清样品为88份,占总样品比例的97.78%,两者差异不显著。【结论】仔猪血清中确实存在具有保护性的抗E2抗体,以间接ELISA检测抗E2抗体来监测猪瘟免疫水平是可行的,这为猪瘟免疫水平的监测提供了一种新方法,也为制定免疫程序提供了科学依据。     

龟源迟缓爱德华氏菌分离鉴定及灭活疫苗研制

【目的】利用从发病死亡的中华草龟(Chinemys reevesii)分离到的病原菌株制备灭活疫苗。【方法】对该菌进行培养特性、生理生化特征、16S rRNA同源性分析、药敏等试验。人工感染中华花龟(Ocadia sinensis),确定半数致死剂量(LD50)。经0.03%甲醛灭活后与铝胶3∶1制成灭活疫苗,对中华花龟进行腹腔注射免疫,测定血清抗体效价,以5LD50活菌浓度进行攻毒试验测定免疫保护率。【结果】分离鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌。两次免疫14 d后抗体效价分别为1∶64和1∶256,在5LD50剂量攻毒后相对免疫保护率分别为60%和73%。【结论】本灭活疫苗二免的相对保护率达73%,有保护效果,可用于龟的迟缓爱德华氏菌病的预防。     

小鼠TRIM59蛋白多克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

【目的】制备兔抗鼠三结构域蛋白59(Tripartite motif-containing 59,TRIM59)多克隆抗体。【方法】利用PCR方法得到小鼠TRIM59基因片段,将其克隆至pGEX-2T原核表达载体中,转入大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达GST-TRIM59融合蛋白。GST-TRIM59融合蛋白经亲和层析纯化浓缩后免疫新西兰大耳白兔,制备多克隆抗体,通过ELISA测定兔抗鼠TRIM59多克隆抗体效价,用Western blot测定其特异性。用免疫组织化学方法检测TRIM59在小鼠前列腺癌组织中的表达。【结果】成功构建了pGEX-2T-TRIM59原核表达重组质粒,并诱导表达出GST-TRIM59融合蛋白,免疫新西兰大耳白兔5周后获得多克隆抗体。ELISA测定结果表明,TRIM59多克隆抗体效价为1∶106以上;Western blot分析表明,TRIM59多克隆抗体具有良好的特异性。免疫组织化学检测发现,TRIM59在小鼠前列腺癌组织细胞中高表达。【结论】成功地制备了特异性良好的兔抗鼠TRIM59多克隆抗体,其具有良好的免疫学活性,能够用于相关研究。     

西农萨能羊MAT基因的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】制备高特异性、高效价的乙酰/丙二酸单酰转移酶(MAT)多克隆抗体,为研究山羊MAT在脂肪酸代谢中的功能奠定基础。【方法】采用PCR方法扩增奶山羊的MAT基因,将其亚克隆到pET32a(+)载体得到pET32a(+)-MAT原核表达载体,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。使用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱纯化融合蛋白,纯化的MAT蛋白经复性后进行活性检测。采用皮下免疫法将纯化的MAT蛋白免疫兔子制备多克隆抗体,用ELISA和Western blot检测血清多克隆抗体的效价和特异性。【结果】PCR扩增得到981bp的MAT基因编码区;成功构建了pET32a(+)-MAT原核表达载体,诱导表达获得了56ku的重组蛋白。活性检测表明,复性后的MAT具有转移酶活性,ELISA检测显示抗体效价达1∶128 000,经Western blot鉴定,制备的多克隆抗体能特异性检测原核表达的MAT蛋白以及在HEK-293细胞中表达的MAT蛋白。【结论】获得了具有酶活性的MAT蛋白以及高特异性、高效价的兔抗MAT多克隆抗体,为研究MAT在脂肪酸代谢中的功能提供了重要的试验工具。     

用低龄动物制备高效价Et免疫血清的探讨

［目的］建立一种用低龄日本大耳白兔制备高效价迟钝爱德华氏菌（Edwardsiellatarda,Et）免疫血清的方法。［方法］先制备迟钝爱德华氏菌（Et）抗原。用日本大耳白兔作免疫动物,分2组试验,一组是2月龄组（T组）,另一组是6月龄（S组）。采取耳缘静脉注射的方法,小剂量连续多次免疫日本大耳白兔,免疫后,收集免疫血清,然后用微量凝集反应法测定免疫血清抗体效价。［结果］凝集反应显示,在免疫剂量相同的情况下,第1次试血测Et免疫血清效价,S组的血清效价比T组的血清效价高,但在第2次试血测Et免疫血清效价时T组的血清效价与S组的血清效价一致。［结论］试验中所采用的T组动物（日本大耳白免）月龄较小,免疫后仍产生了与S组一致的高效价抗血清,说明用低龄日本大耳白兔制备高效价Et免疫血清的方法可行。     

卵形鲳鲹RelB蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】制备卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）RelB蛋白（TroRelB）多克隆抗体,为深入研究TroRelB蛋白的结构、功能及蛋白—蛋白相互作用打下基础。【方法】将TroRelB基因与pET-32a表达载体连接构建pET-32a-TroRelB重组质粒,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受态细胞,采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,以Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化的TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体,应用ELISA和Western blotting分别检测抗体效价及特异性。【结果】以构建的pET-32a-TroRelB重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导能成功表达获得TroRelB重组蛋白,其相对分子量为84.0 kD,且主要以包涵体的形式进行表达。经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化透析的TroRelB重组蛋白浓度为0.498 mg/mL,能被抗His标签抗体识别。以纯化TroRelB重组蛋白免疫Balb/C小鼠获得抗TroRelB血清（多克隆抗体）,ELISA检测结果显示其抗体效价为1:256000;Western blotting检测结果显示,5和15 ng的TroRelB重组蛋白均可特异性结合TroRelB多克隆抗体,而阴性对照（免疫前血清）未出现预期条带。【结论】原核系统诱导表达的TroRelB重组蛋白主要以包涵体的形式进行表达,且携带有His标签,以其免疫Balb/C小鼠制备获得的TroRelB多克隆抗体具有较强的特异性和较高的抗体效价,可用于深入研究TroRelB蛋白的生物学功能及揭示卵形鲳鲹的免疫机制。     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

鸭病毒性肝炎间接血凝诊断抗原的制备

【研究目的】建立一种便于检测鸭病毒性肝炎抗体的方法。【研究方法】将纯化的鸭病毒性肝炎I型病毒(DHV-I)致敏双醛化红细胞,制备检测DHV抗体的间接血凝诊断抗原。【研究结果】使用该抗原对9种常见的禽传染病阳性血清、15只随机抽样的非免疫鸭血清进行检测,抗体均为阴性;检测被鸭病毒性肝炎I型病毒阻断后的阳性血清,抗体为阴性;用不同批次的诊断抗原检测同一血清样品结果显示一致;敏感性是琼脂扩散试验的32～64倍;对15只随机抽样的免疫鸭进行检测,阳性率达93%。【结论】该方法敏感性较高、特异性强、重复性好,可用于疫苗免疫后抗体水平的检测及鸭病毒性肝炎的流行病学调查。     

快速检测生鲜肉中三种食源性致病菌

为同时快速检测生鲜肉中鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和福氏志贺氏菌3种食源性致病菌,降低检测成本,制备了特异性单克隆抗体和多克隆抗体,研制出能够同时检测以上3种致病菌的胶体金免疫层析试纸条。结果表明,本试验成功筛选出3株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株2E3、2E7和2E8,3种单克隆抗体效价均在1.28×10~6以上,3种多克隆抗体效价均在2.00×10~6以上。制备的胶体金免疫层析试纸条对鼠伤寒沙门氏菌、单增李斯特菌和福氏志贺氏菌3种食源性致病菌的特异性良好,灵敏度均为1×10~4CFU/g。