抗黄曲霉毒素单链抗体在毕赤酵母X-33中的表达

为降低黄曲霉毒素单链抗体制备成本,提高单链抗体表达活性,利用获得的含抗黄曲霉毒素scFv基因的重组质粒pCANTAB 5E-scFv1A7,克隆出了scFv基因片段,并构建了酵母表达载体pPICZαA-scFv1A7,利用SacⅠ酶将重组载体线性化后插入到毕赤酵母X-33染色体基因组中,构建了pPICZαA-scFv1A7 X-33重组酵母,用0.8%甲醇诱导其分泌表达成功。间接竞争ELISA方法检测到该scFv对黄曲霉毒素B1的抑制率(IC50)值为4.5ng/m L,表明重组酵母表达产物scFv具有很好的抗原结合活性,可用于黄曲霉毒素的检测。     

高粱花叶病毒Hcpro、CP和PIPO基因酵母双杂交载体构建及自激活验证

采用同源克隆技术获得侵染甘蔗高粱花叶病毒(Sorghum mosaic virus,SrMV)的Hcpro、CP、PIPO基因片段.将该基因片段连接至pGBKT7载体,分别构建酵母双杂交诱饵载体pGBKTT-Hcpro、pGBKT7-CP和pGBKTT-PIPO,经PCR、酶切及测序鉴定,证明重组诱饵载体构建成功后,将重组质粒导入Y2H Gold酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性.含重组诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade和SD/-Trp/-His营养缺陷平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对ADE2、HIS3报告基因无自激活作用.研究结果为下一步利用酵母双杂交系统检测与高粱花叶病毒Hcpro、CP、PIPO蛋白相互作用的甘蔗蛋白提供基础.     

葡萄糖对组成型毕赤酵母发酵产α-葡聚糖酶的影响

本文主要考察葡萄糖对毕赤酵母生长和组成型表达α-葡聚糖酶的影响。采用单因素实验法考察初始发酵培养基中葡萄糖浓度、补料阶段葡萄糖残留、通气量等对α-葡聚糖酶产量的影响。结果表明发酵培养基中初始葡萄糖浓度50g/L最佳,提高初始葡萄糖浓度,毕赤酵母生长和α-葡聚糖酶产量都明显受到影响。补料过程葡萄糖残留越小越有利于酶的表达,最理想的控制应该是葡萄糖残留几乎为零,但又保证能满足菌体的生长和表达需要。提高通气量有利于增加α-葡聚糖酶的产量,发酵时间66h为宜。在优化条件下,α-葡聚糖酶酶活达16537U,为利用葡萄糖生产α-葡聚糖酶打下基础。     

大豆PM2蛋白(LEA3)表达可提高酵母重组子的耐盐性

大豆PM2蛋白属LEA3(late embryogenesis abundant group3)蛋白.本实验以含大豆PM2基因的重组载体pET28a/PM2为模板,PCR法构建酵母表达载体pYES2/PM2,并转化酵母细胞得到重组菌INV/PM2.SDS-PAGE电泳结果表明,INV/PM2重组菌可被诱导表达分子量约为50 kDa的蛋白条带,与目的蛋白的理论分子量(50 kDa)接近.利用液相色谱-电喷雾质谱对酵母重组子表达的重组蛋白进行分析鉴定.分别测定未转基因重组菌INV/pYES2和转PM2基因的重组菌烈V/PM2在无胁迫、和含1.8 mol/LNaCl、2 mol/L山梨糖培养基中的生长曲线.结果表明大豆PM2蛋白的表达对酵母正常生长没有影响.在含高盐的培养基里,转PM2基因酵母INV/PM2的延滞期短于对照菌.这表明PM2蛋白的表达可以提高酵母细胞的耐盐能力.但是在含山梨糖的高渗培养基里,两种菌的生长情况无明显差异.     

香蕉ROP1基因酵母双杂交体系的诱饵载体构建及毒性与自激活效应检测

用PCR技术获得香蕉ROP1基因片段,构建酵母双杂交系统表达载体pGBKT7-ROP1,测序正确后将重组质粒导入AH109酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用.结果表明,用PCR技术获得了正确的ROP1基因片段,并正确构建了ROP1基因的酵母双杂交表达载体,并转化到AH109酵母菌株中,含诱饵载体的AH109在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,含诱饵载体的AH109在His、Trp二重营养缺陷平板上不能生长,说明对报告基因无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统筛选与ROP1蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

镉胁迫下能源甜菜BvGST基因在酵母中的功能分析

植物谷胱甘肽转移酶(GSTs)在正常生长条件下的细胞代谢以及由于重金属胁迫所带来的解毒过程中,都发挥着重要作用。为了进一步研究BvGST基因在能源甜菜镉逆境胁迫中的功能,本研究利用RT-PCR的方法,从能源甜菜体内克隆获得了Beta vulgaris glutathione S-transferase(BvGST,LOC104898671)基因。利用酵母表达载体构建pYES2-BvGST重组质粒,并转化到酵母InVSc1中。SqRT-PCR结果表明,与内参基因ACT1相比,BvGST基因可以受到半乳糖的诱导从而适量表达。当施加0.5 mmol/L CdCl2逆境胁迫后,适量表达BvGST重组菌的生长状态和趋势要明显优于对照菌株(转化pYES2的酵母),并具有相对更高的Cd耐受性。因此可以推断,能源甜菜BvGST基因在镉逆境胁迫过程中发挥着重要的作用,并有可能通过GST介导的氧化逆境的活性解毒,从而参与到细胞对重金属镉离子的代谢平衡调控过程中。     

三角褐指藻 LPAAT基因在酵母中表达对脂肪酸的影响

从三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中克隆到1 632bp的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)全长cDNA,其中包含的开放阅读框被命名为PtLPAAT。在毕赤酵母中异源表达PtLPAAT基因,诱导培养45h时随机选取的3个酵母转化子总脂肪酸含量分别提高了2.68%、11.14%、31.28%;诱导培养72h时同样的转化子总脂肪酸含量分别提高11.59%、18.72%、46.63%。用薄层层析法分离48h后的酵母菌体的甘油三酯,并用气相色谱法测定其脂肪酸,结果显示：与非转基因对照菌株相比,其油酸提高了0.9倍、亚油酸提高了5倍。用荧光定量PCR检测发现PtLPAAT基因的表达量随三角褐指藻油脂不断积累逐渐升高。表明在酵母中表达PtLPAAT基因不仅能够明显地提高其脂肪酸含量,而且还能选择性结合不饱和脂肪酸到甘油三酯中。     

PRSV NIa-pro、NIa-vpg、NIb酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测

用PCR技术获得NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,将这些基因分别克隆到pBD-GAL4载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pBD-GAL4-NIa-pro、pBD-GAL4-NIa-vpg和pBD-GAL4-NIb.测序正确后,将重组质粒导入YRG-2酵母菌株,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用.结果表明,获得了正确的NIa-pro、NIa-vpg、NIb基因片段,并成功克隆到pBD-GAL4诱饵载体中,且转化有诱饵载体的YRG-2在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,说明表达产物对酵母细胞无毒性,对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测与NIa-pro、NIa-vpg、NIb蛋白相互作用的蛋白奠定基础.     

高密度发酵P.pastoris组成型表达纤维素二糖水解酶

用PCR法扩增里氏木霉cbhⅡ基因,并将其克隆到P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP9K-cbhⅡ。通过电转法将cbhⅡ基因整合到P.pastoris的基因组中,然后筛选高G418抗性的克隆作为工程菌菌种。在生物反应器中生产CBHⅡ,将20L发酵液装入50L的发酵罐中,在发酵过程中连续64h补加甘油-PTM4,放罐时生物量为A600=170,CBHⅡ的表达量为75mg/L。其表达产物具有酶解羧甲基纤维素的活性。     

响应面法优化热带假丝酵母ypy06植酸酶发酵条件的研究

从海南洋浦近海分离到1株产植酸酶的酵母菌株,经鉴定为热带假丝酵母(Candida tropicalis),利用Plackett-Burman设计对其发酵条件进行了筛选。结果表明,豌豆粉浓度、硫酸铵浓度和初始pH对酶产量具有显著的影响;利用响应面法对3个因子进行了优化,获得了最佳发酵条件：豌豆粉1.0%,葡萄糖2.0%,硫酸铵1.7%,氯化钠1.0%,初始pH 5.2,培养72 h,植酸酶产量达到727.5 U/mL。