利用冷冻的GV期卵母细胞制备延边黄牛核移植胚胎的研究

研究使用玻璃化冷冻、程序化冷冻和超快速冷冻3种方法冷冻延边黄牛的卵母细胞,确定适宜的延边黄牛核移植受体卵母细胞的冷冻方法。结果显示,3种冷冻方法处理的GV期卵母细胞在成熟率上相似,玻璃化冷冻法得到的卵母细胞形态正常率要高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),超快速冷冻法回收率最低。采用玻璃化冷冻法,核移植重组胚卵裂率明显高于程序化冷冻和超快速冷冻法(P<0.05),在融合率上,3种方法差异不显著。表明玻璃化冷冻方法对延边黄牛GV期卵母细胞冷冻效果优于程序化冷冻和超快速冷冻方法,是一种较适合延边黄牛核移植的卵母细胞冷冻方法。     

延边黄牛体细胞核移植胚胎编码抗氧化酶的基因表达研究

为研究延边黄牛体细胞核移植(SCNT)胚胎编码过氧化氢酶(CAT)、锰超氧化物酶(Mn-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的mRNA表达情况,以孤雌激活(PA)胚胎为对照,利用反转录PCR扩增延边黄牛SCNT胚胎编码CAT、Mn-SOD和GPx的mRNA,琼脂糖凝胶电泳后使用计算机软件进行半定量分析。结果显示:延边黄牛SCNT胚胎编码CAT的基因在2细胞期开始表达,且与PA胚胎存在显著差异(P0.05);编码Mn-SOD的基因在8细胞期开始表达,与PA胚胎在16细胞期以上时期差异显著(P0.05);编码GPx的基因在4细胞期开始表达,与PA胚胎在4细胞期差异显著(P0.05),8细胞期以上时期差异不显著(P0.05)。与孤雌激活胚胎的差异表明SCNT胚胎抗氧化酶表达的异常可能是由核移植操作过程所引起的。     

延边黄牛体细胞克隆胚胎氧化损伤的初步研究

为了优化体细胞克隆胚胎体外培养液,提高体细胞的克隆效率,以CRlaa+5% FBS+0.3%BSA为基础培养液,分别添加0、60、80、100和120 μmol/L H_2O_2观察延边黄牛体细胞克隆胚胎的氧化损伤情况和体外发育模式,并研究1、4和7 mmol/L GSH对延边黄牛重组胚的保护作用.结果表明:(1)添加0、60、80 μmol/LH_2O_2组卵裂率显著要高于100 μmol/L和120 μmol/L组(P<0.05),添加H_2O_2的组囊胚发育率显著低于未添加组(P<0.05);(2)随着H_2O_2处珲浓度的升高,重组胚发育速度增加,但是发育停滞现象也更明显;(3)在培养液中添加GSH后,1 mmol/L组卵裂率显著高于7 mmol/L组(P<0.05),与0和4 mmol/L组差异不显著(P>0.05),囊胚发育率显著高于其它组(P<0.05).可见,在体细胞克隆胚胎体外发育过程中H_2O_2对其具有氧化损伤作用,不利其体外发育,在培养液中添加1 mmol/L GSH对体细胞克隆胚胎的氧化损伤具有明显的保护作用.     

黄牛孤雌胚胎的体外培养

试验研究了培养液中血清的添加时间和添加浓度及不同培养体系对黄牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响.结果表明.黄牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天添加10%的FBS对孤雌胚的体外发育效果较好;4种培养体系在孤雌激活后的第3天添加10%的FBS.平均囊胚率分别可达46.25%(SOFaa)、43.58%(Crlaa)、40.25%(KSOM)和17.98%(TCM199);TCM199组的囊胚率显著低于其他3组(P<0.05),SOFaa组优于Crlaa和KSOM组,但差异不显著(P>0.05).表现最好的是黄牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天在SOFaa组中添加10%的FBS,其平均囊胚率可达46.25%.     

延边黄牛体细胞克隆激活条件的研究

从激活前恢复时间、激活方式、激活培养时间等3个方面研究延边黄牛体细胞克隆的适宜激活条件.结果表明:延边黄牛体细胞克隆激活的理想条件为激活前恢复培养25~30 min,采用离子霉素(Ionomycin,Ion) 6-Dimethyaminopurin(6-DMAP)激活方式,激活培养4 h.     

延边黄牛产业发展的经济分析

对延边黄牛产业的生产状况和潜在的优势进行了分析,找出了存在的问题,并根据延边黄牛产业实际情况,提出进一步发展延边黄牛产业的相关建议。     

挤压去核法和盲吸去核法在延边黄牛体细胞核移植中的对比研究

分别采用挤压去核法和盲吸去核法对延边黄牛卵母细胞进行去核处理,之后进行核移植,培养观察,比较两种去核方法对延边黄牛体细胞核移植效率的影响.挤压法的操作成功率和去核率明显高于盲吸法,盲吸法操作程序耗时比挤压法长,但是差异不显著.两种方法获得了相近的卵裂率和囊胚率,但挤压法构建的重组胚在囊胚数上高于盲吸法.挤压法在延边黄牛体细胞核移植上比盲吸法更有效.     

改进的末期去核方法解决延边黄牛卵母细胞第一极体残留问题

传统的末期去核方法仅仅去掉了第二极体及其附近少量的细胞质,第一极体仍然残留在卵母细胞中.本研究中,将末期去核方法进行了改进,即在去除第二极体及其附近少量胞质的同时去除第一极体.采用改进的末期去核法和传统的末期去核方法对延边黄牛卵母细胞进行去核操作,比较两种方法的去核率以及重组胚后期发育的整体效率.改进的末期去核法在去核率[(90.51±3.05)%]以及囊胚形成率[(8.78±2.38)%]上与传统的方法[分别为(87.00±1.82)%、(6.56±2.95)%]相似;传统的末期去核法在去核操作上耗时较长[(44.13±2.60)s],但在注核操作上用时略短于改进的末期去核法[(30.33±1.17)s];改进的末期去核方法所构建的重组胚异常发育率比传统的末期去核法低[(18.02±2.83)%],但差异不显著.改进的末期去核方法,去除第一、第二极体及其附近少量细胞质,可达到较高的去核率,并且支持发育到囊胚,同时解决了第一极体残留的问题.     

延边黄牛心脏的形态学观察

采用常规解剖学方法,测量20头延边黄牛的心室壁厚度、各瓣膜口的周径、心脏外部各径;对延边黄牛心脏的外部形态、位置关系、内部构造、血管分布、肉柱等进行观察．结果表明,延边黄牛心脏的重量为（1．17±0．27）kg,位于胸腔的纵隔内,呈倒置的圆锥状,分为右心房、右心室、左心房、左心室4个腔,外部有心包包被．心脏周径（36．31±3．13）cm,长径（12．71±0．57）cm;心脏的外形可分为心耳,心室,心尖和心底,表面有4条沟（冠状沟,锥旁室间沟,窦下室间沟和中间沟）;左心室心内膜光滑、平整,肉柱较右心室内的少;左心室内有2个乳头肌,即前乳头肌和后乳头肌,均发达,为附着型,标本中见右心室内有3个乳头肌,分别为隔后乳头肌、隔前乳头肌和侧壁乳头肌．     

细胞松弛素B对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

探讨融合液、激活液中添加细胞松弛素B(CCB)对延边黄牛体细胞核移植效率的影响,以摸索适合延边黄牛体细胞核移植的电融合、激活条件。结果表明,融合液中添加7.5μg/mL CCB组的桑葚胚及囊胚发育率显著高于其他3组;激活液中添加5.0μg/mL的CCB组的卵裂率、桑葚胚及囊胚发育率显著高于其他3组;融合液、激活液中同时添加CCB的囊胚发育率高于单独添加组,但是差异不显著。     

不同融合液对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

[目的]探寻适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液。[方法]用延边黄牛颗粒细胞为供体细胞。试验1,比较3种浓度(0.25、0.280、.30 mol/L)3种融合液(蔗糖、D-山梨醇、甘露醇)对核移植胚胎融合率及重组胚体外发育的影响。试验2,比较3种0.28 mol/L融合液对核移植效率的影响。[结果]3种浓度的蔗糖、D-山梨醇、甘露醇融合液的融合率和卵裂率差异均不显著,但0.28 mol/L融合液处理的重组胚后期发育相对较好。3组融合液融合率(88.44%、86.83%、86.85%)差异不显著,蔗糖、甘露醇融合液卵裂率(87.98%、86.06%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(78.64%);蔗糖、甘露醇融合液囊胚发育率(22.16%、19.91%)差异不显著,在0.05水平上显著高于D-山梨醇融合液(10.14%)。[结论]适宜延边黄牛体细胞核移植的最佳融合液为0.28 mol/L蔗糖融合液。     

延边黄牛体细胞克隆囊胚中总基因组RNA的提取

以延边黄牛体细胞克隆囊胚为试验材料,采用试剂盒GMS12106的使用方法提取试材的总基因组RNA,在琼脂糖凝胶电泳检测后,得到最适的囊胚数为5个。通过试验发现,生殖细胞的特殊生理结构限制了RNA提取的效果。为提取完整、纯度高的RNA,采用链蛋白酶对囊胚的透明带进行了消化处理,最终得出链蛋白酶处理的最适时间为10min,提取的RNA质量好,可为后续试验奠定基础。     

植物细胞活性氧及其胞内信号转导

研究表明,活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)有很高的生物学活性,高浓度的活性氧是毒性分子,可以引起细胞内大分子的氧化损伤;低浓度的活性氧则作为普遍存在的信号分子起作用,ROS能诱导细胞防御基因的表达和引起适应性反应。     

谷氨酸对延边黄牛体细胞克隆重组胚发育的影响

为了提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率,试验研究了在培养液中添加一定浓度的谷氨酸对延边黄牛克隆重组胚发育的影响。选择成熟了20～22 h并且排出第一极体的卵母细胞进行去核与注核,然后进行体外培养,观察卵母细胞的卵裂以及囊胚发育情况。结果显示,低浓度的谷氨酸能够提高重组胚的卵裂率,高浓度则抑制卵母细胞的卵裂;而囊胚的发育方面,低浓度的谷氨酸会降低其发育率。所以,添加适量浓度的谷氨酸能够提高延边黄牛体细胞克隆重组胚的发育率。     

不同受体胞质对延边黄牛体细胞核移植效率的影响

为确定延边黄牛体细胞核移植过程中卵母细胞的最佳去核时期,本试验选取体外成熟22 h的中期(MⅡ期)卵母细胞与体外成熟28 h的末期(TⅡ期)卵母细胞进行化学辅助去核操作,并将去核的卵母细胞作为受体构建重构胚,后期观察发育情况.结果显示,M期卵母细胞的显核率与TⅡ期卵母细胞的显核率无显著差异;但是TⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率均显著高于MⅡ期卵母细胞所得重构胚的卵裂率及囊胚率.综上所述,卵母细胞体外成熟28 h后的TⅡ期可作为延边黄牛核移植去核操作的理想时期,在TⅡ期卵母细胞中选择化学辅助去核法去核能够提高延边黄牛体细胞克隆的效率.     

活性氧物质在植物抗病中的作用

简述了活性氧的产生及清除。综述了活性氧在植物抗病中的作用,主要包括:直接杀死入侵病原菌,增强细胞壁的强度和氧化交联,诱导植保素合成、系统获得抗性、过敏性反应、细胞程序性死亡和防卫基因的表达,激活或与其他信号分子协同作用。总结了活性氧在植物体中的负作用。     

盐生植物活性氧的酶促清除机制

盐生植物的耐盐性常与其有效的抗氧化系统有关。植物的抗氧化系统分为酶促反应系统和非酶促反应系统 ,其中酶促反应系统主要包括超氧化物岐化酶(SOD) ,过氧化氢酶 (CAT) ,抗坏血酸过氧化物酶 (APX) ,过氧还蛋白 (PRX)和谷胱甘肽转移酶(GST)等