利用DNA shuffling技术鉴定草甘膦N-乙酰转移酶抗性相关位点

为研究高抗草甘膦N-乙酰转移酶（glyphosateN-acetyhransferase，GAT）的草甘膦抗性相关位点，以高抗草甘膦的gatl基因和不具草甘膦抗性的gat2基因为出发基因，通过一轮双基因DNAshuffling，获得了抗性较野生型gatl下降的突变体14个：10个单位点突变，3个双位点突变，1个3位点突变。其中，MTGAT3（H41Q）、MTGAT5（$52P）、MTGATT6（153M）、MTGAT7（F56L）、MTGAT8（R82G）、MTGAT11（119T／1722L）和MTGAT14（Y70H／L98P／K119E）7个突变体的草甘膦抗性几乎丧失。本工作为深入研究GAT1蛋白分子结构与功能之间的关系奠定了基础。     

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT PCR、Western 杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03 μg/g 鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。     

草甘膦胁迫对马唐抗氧化酶系及丙二醛含量的影响研究

研究了在不同浓度草甘膦胁迫下,马唐(Digitaria sanguinalis L.)体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等3种抗氧化酶活性及其丙二醛(MDA)含量随时间的变化情况。结果表明:马唐在草甘膦胁迫初期,3种酶活性和MDA含量较对照值有所提高;草甘膦处理6 d后,各指标均达到最高值;第9天后,各指标开始下降;至第12天后,450、900和1 800 g/hm2草甘膦处理马唐的SOD、POD、CAT活性及MDA含量均降至对照水平。这表明草甘膦对马唐的伤害在经过一定时间的生长发育后可恢复,说明马唐对草甘膦较易产生抗药性。     

耐草甘膦大豆种质资源筛选的研究

通过田间试验结合室内生物测定的方法,对不同大豆品种(系)进行了耐草甘膦特性的筛选,以期获得耐草甘膦大豆育种的新种质资源。结果表明,在草甘膦常规剂量下,不同大豆品种(系)对草甘膦耐性程度有着较大差异。褐皮豆和绥无腥豆1号耐性程度较强;DS系列大豆对草甘膦的耐性明显高于其他品系。通过室内生物测定对耐性程度较高的品种(系)进行进一步研究发现,DS品系等4个品系的耐性程度较高,其耐性倍数分别为4.23、3.82、2.93、2.59和2.48。室内考种数据表明,草甘膦虽然对耐性品系的株高有不同程度的抑制;但耐性品系可以正常的成熟结实,在单株荚数、百粒重等重要指标上具有可利用价值。     

转Epsps基因大豆RR47对常规除草剂耐性的室内测定

通过室内盆栽转Epsps基因大豆RR47、受体大豆SW47和对照大豆吉育84,分别对其进行常规除草剂乙草胺、精禾草克与咪草烟混用和目标除草剂草甘膦的不同水平处理。结果表明:①对常规除草剂转基因大豆RR47和受体大豆SW47之间耐性基本相同,而转基因大豆RR47和受体大豆SW47比对照大豆吉育84对常规除草剂的耐性弱。表明不同大豆品对常规除草剂的耐性存在差异,与抗草甘膦基因的转入无关。②对目标除草剂草甘膦转基因大豆RR47的耐性极高,具有垂直抗性。受体大豆SW47和对照大豆吉育84对目标除草剂草甘膦无耐性。表明转基因大豆RR47与非转基因大豆SW47和吉育84有本质的区别,可以通过转基因技术获得新的性状。     

农杆菌介导的抗草甘膦基因(sxglr-11)的玉米遗传转化

利用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法将抗草甘膦基因(sxglr-11)导入优良玉米再生系HiII,共转化幼胚1 673个,分化出再生苗67株,其中,28株移栽成活,经PCR检测13株为阳性植株,阳性率为46.4%。采用草甘膦浓度梯度筛选,确定了未转基因的对照植株的致死浓度范围为1%～2%。利用2%的草甘膦对T0转基因植株6～8叶龄苗的叶片进行涂抹,结果表明,阳性植株均具有草甘膦抗性。T1植株经2%草甘膦抗性筛选,转基因植株表现出3∶1的孟德尔分离方式。     

转基因抗草甘膦棉花对草甘膦的耐受性研究

为了明确转基因抗草甘膦棉花10-6001对除草剂草甘膦的耐受性,以转基因抗草甘膦棉花材料10-6001和常规棉花品种冀棉958（ CK）为试验材料,在棉苗6片真叶时叶面喷施不同浓度〔0（不喷施除草剂,人工除草, CK）、0.25％和0.50％〕的草甘膦溶液,分别于施药后0（当天下午）、1、7、14和21 d调查棉花的株高、药害级别、受害指数和死苗率,施药后35 d 调查棉花的死苗情况;分析2种棉花对不同浓度草甘膦的反应程度,并对其株高差异进行了显著性方差分析。结果表明：转基因抗草甘膦棉花品系10-6001对草甘膦的耐受性很好,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花在整个试验期间药害均较轻,表现为植株矮化,生长减慢,叶片略变小,且无死苗,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均不显著;随着时间的延长,药害逐渐缓解。而常规品种冀棉958对草甘膦的耐受性很差,喷施0.25％和0.50％草甘膦溶液的棉花药害症状表现为植株矮化,生长缓慢,叶片变小、枯黄、褐化干枯,并且药害程度随着时间的延长而加重,药害级别和受害指数均高于10-6001,株高方差分析结果显示与人工除草（ CK）相比差异均达到了极显著水平,施药后35 d部分棉花出现整株枯死。     

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1-L3来自自交系9801,Q1-Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米,赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。     

转基因抗虫、耐除草剂及品质改良复合性状玉米BBHTL8-1的分子特征及功能评价

随着转基因作物的发展和推广,具有复合性状的转基因作物种植面积逐年增加.传统的转基因复合性状作物具有抗虫和耐除草剂性能,聚合其他性状的转基因作物培育逐渐受到重视.转基因玉米株系BBHTL8-1含有Cry1Ab、Cry3Bb、cp4epsps 、ZmHPT和ZmTMT共5个基因表达框,外源插入片段位于玉米基因组第4染色体,...     

抗草甘膦基因(EPSPS)植物双价表达载体的构建

针对目前报道的抗草甘膦转基因作物中,强组成型启动子驱动抗草甘膦基因在转基因植物的所有部位和所有发育阶段都表达,增加植株代谢负担,对植物的产量可能引起负效应的这一问题,利用Ag2这种草甘膦胁迫诱导启动子来驱动epsps基因,只在草甘膦喷施后高效表达对草甘膦的抗性.另外,同时利用具有组织特异性的启动子RuBP,使epsps基因在植物草甘膦农药田间喷施主要部位叶片中高效表达,应可以进一步增强转基因植物的抗草甘膦能力,但又不致过多地增加转基因植物的代谢负担,以利培育高抗草甘膦且农艺性状优良的转基因植物.实验分别以pBI121-E-M-Bt(Kanar)和pBI121-CP4E(Kanar)质粒为基础,通过载体pUC19及对EcoRⅠ位点的接头改造,构建了由RuBP启动子和新发现的诱导型启动子Ag2共同调控epsps基因的植物表达载体pGBI-Ag2EM-RuBPEM和pGBI-Ag2CP4E-RuBPCP4E,选择标记为卡那霉素,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导的浸花法转化拟南芥,获得了T0代种子,为利用epsps基因改良植物对草甘膦的抗性奠定了物质基础.     

Identifying glyphosate-tolerant maize by soaking seeds in glyphosate solution

The identification of glyphosate-tolerant maize genotypes by field spraying with glyphosate is time-consuming, costly and requires treatment of a large area. We report a potentially better technique of seed-soaking to identify glyphosate-tolerant maize genotypes. The effects of soaking maize seeds in glyphosate solution under controlled conditions were studied on seed germination rate, seedling morphological indices, seedling growth and leaf chlorophyll content. These responses were compared among a glyphosate-tolerant transgenic maize cultivar CC-2, glyphosate-susceptible inbred line Zheng 58 (the recurrent parent of CC-2) and hybrid cultivar Zhengdan 1002. The results showed that the germination rate, seedling morphological indices and leaf chlorophyll content of glyphosate-tolerant CC-2 seeds did not change significantly among five different concentrations of glyphosate treatment (0 to 2%). In contrast, germination rates, seedling morphological indices and leaf chlorophyll contents of Zheng 58 and Zhengdan 1002 seeds were significantly negatively affected by exposure to increasing concentrations of glyphosate. The glyphosate-tolerant inbred line CC-2 displayed a strong tolerance to glyphosate after soaking in 0.1 to 2.0% glyphosate solutions, while both the inbred line Zheng 58 and hybrid Zhengdan 1002 were susceptible to glyphosate. The accuracy of the glyphosate-soaking method for screening glyphosate-tolerant maize was confirmed using a field spraying trial.     

烯效唑对草甘膦伤害玉米幼苗的缓解作用

探讨烯效唑(S-3307)缓解草甘膦对玉米幼苗的伤害作用.以2 440 mg/L草甘膦为对照,对玉米幼苗喷施不同浓度的S-3307(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L)与草甘膦混合溶液,系统分析了幼苗形态、地上部鲜重、叶绿素、保护酶和细胞膜的变化.结果表明:与单独施用草甘膦相比,添加S-3307(10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L)能显著提高玉米幼苗地上部鲜重和叶绿素含量,也在一定程度上提高叶片内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和叶绿体过氧化氢酶(CAT)的活性,显著降低丙二醛(MDA)含量.这说明S-3307可通过提高抗氧化酶活性来保护膜的结构和功能,缓解草甘膦对玉米幼苗的伤害作用.尤以50 mg/L S-3307与草甘膦混用缓解效果最显著.     

薤白EPSP基因对亚麻的转化及检测

薤白EPSP基因编码5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶,对除草剂草甘瞵具有一定的抗性.利用该基因构建植物表达重组体.薤白EPSPcDNA重组到植物表达载体pWM101中,构建成35S启动子控制的植物组成型表达载体,利用农杆菌介导法将其转入亚麻,经过潮霉素筛选获得了抗性的愈伤组织,诱导分化后获得了亚麻苗.经特异引物的PCR扩增,证明目的基因已经整合到亚麻基因组中,对转基因亚麻愈伤组织及幼苗进行的草甘膦抗性检测表明,转基因亚麻对草甘膦的耐受性明显提高.     

山麻鸭睾丸和肝脏中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离提取及其性质的比较

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)比活力为85.30 U.mg-1,纯化倍数为10.48.睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537.00 U.mg-1,纯化倍数为59.20.睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点pI为5.05.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5.70和5.60,酶在pH为3.00-8.43时较稳定,而pH>8.43时很快失活;酶的最适温度分别为45和60℃,当温度为80℃时酶完全失活.睾丸NAGase在40℃下处理30 min,酶活力保持稳定;而肝脏NAGase在30℃下处理30 min,酶活力保持稳定,酶催化pNP-NAG水解反应遵循米氏方程,睾丸和肝脏NAGase水解pNP-NAG的Km分别为0.17和0.21 mmol.L-1,Vm分别为8.82和7.25μmol.L-1.min-1,活化能分别为57.57和79.47 kJ.mol-1.     

原位聚合法制备草甘膦微胶囊

采用原位聚合法制备以脲醛树脂为壁材的草甘膦微胶囊除草剂。探讨了缩聚反应条件对微胶囊粒径及其分布和微胶囊结构的影响,并考察了微胶囊的包封率和缓释性能。结果表明,以氯化铵为酸性催化剂,酸化时间为4 h,终点pH2.0,固化温度70℃,固化时间2 h,搅拌速度2 000 r.min-1,乳化剂采用苯乙烯-马来酸酐（SMA）,可制得包封率为91.9%,粒径分布均匀且粒径1~10μm的流动性球型固体微胶囊。以上结果及应用试验均显示该微胶囊能够满足实际需要。     

草甘膦残留的酶联免疫分析方法的建立

通过碳化二亚胺法将草甘膦(Glyphosate,GLY)分别与卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联制备免疫原和包被原。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)检测表明,草甘膦与牛血清白蛋白和卵清蛋白的偶联比分别为11∶1和9∶1。合成的免疫原作用新西兰大白兔制备出草甘膦多克隆抗体,ELISA检测抗体溶液效价为1∶1×107,该抗体不与草甘膦的结构类似物增甘膦和双甘膦起交叉反应。以此抗体建立了草甘膦间接竞争ELISA检测方法(ciELISA),其线性范围为0.78～100μg/mL,线性回归方程为y=15.851 0 lnx+7.780 5,R2=0.993 8。草甘膦的检测限为IC10=1.15μg/mL,IC50=14.35μg/mL。在添加回收试验中,草甘膦添加值5和10μg/g时,玉米粉中的草甘膦回收率为104.12%和81.37%,小麦粉中的回收率则分别为118.94%和为109.39%。结果表明,采用所制备的多克隆抗体而建立的草甘膦ciELISA方法可有效地应用于玉米粉和小麦粉中草甘膦的残留检测。     

Weed and insect control affected by mixing insecticides with glyphosate in cotton

Field studies were conducted in 2012 and 2013 to evaluate weed and insect control efficacy with glyphosate at 1 230 g ai(active ingredient) ha~(-1) and the insecticides acephate(728 g ai ha~(-1)),carbosulfan(135 g ai ha~(-1)),endosulfan(683 g ai ha~(-1)),imidacloprid(32 g ai ha~(-1)),or lambda-cyhalothrin(23 g ai ha~(-1)),as well as glyphosate tank-mixed with these insecticides.Four of the most common weeds in cotton,common purslane,false daisy,goosegrass,and lambsquarters,were manually sown in the cotton field and treated with glyphosate alone or in combination with insecticides.Glyphosate efficacy,based on visual estimates of control and weed fresh weight at 21 d after treatment(DAT),was unaffected by the addition of insecticides.Four weeds were controlled by 93-97%and 86-100%(visual rating) and reduced weed fresh biomass by98-99%and 96-100%with glyphosate alone and its combination with insecticides,respectively.Addition of glyphosate to acephate improved cotton aphid control compared with acephate alone.However,addition of glyphosate to carbosulfan,endosulfan,imidacloprid,or lambda-cyhalothrin did not affect the aphid control when compared with the insecticide alone treatments.These results indicate that cotton producers could potentially integrate weed and insect management strategies by choosing suitable insecticide mixing partners with glyphosate,thereby reducing the application costs without sacrificing the efficacy of the glyphosate or the insecticides.     

干旱胁迫下草甘膦对抗草甘膦大豆幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响

【目的】为探明干旱胁迫(5d)及旱后复水条件下不同草甘膦剂量对抗草甘膦大豆(RR1)幼苗保护酶活性及脂质过氧化作用的影响。【方法】采用盆栽试验,在大豆的第三复叶期进行水分胁迫和草甘膦处理。【结果】(1)正常水分条件下,草甘膦增加了RR1的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性,以及丙二醛(MDA)含量和相对电导率(EL),且随剂量的增加和处理5d内时间的延长而升高;草甘膦处理17d后,各指标均有所下降。(2)干旱条件下,较低剂量的草甘膦处理使RR1的SOD、POD、CAT活性随胁迫时间的延长而升高,0.92kg·hm-2处理的各保护酶活性随胁迫时间的延长呈先增加后降低趋势;然而,各剂量处理的MDA含量和EL均在胁迫第5天上升到最大;各指标在复水12d后均有所下降。(3)干旱条件下草甘膦处理的SOD、POD、CAT活性以及MDA含量和EL均高于正常水分条件下草甘膦处理。【结论】正常水分条件下,草甘膦对RR1幼苗造成的伤害可以经过一段时间的生长发育有所缓解;而干旱胁迫加剧了草甘膦对RR1幼苗伤害的原因是活性氧代谢失衡,保护酶系的活性发生变化,质膜过氧化程度加大,短期干旱胁迫后复水可提高细胞膜的抗干旱能力或适应胁迫的能力。     

磷与草甘膦在酸性土壤中吸附解吸交互作用机制

过量的磷肥和草甘膦是我国南方土壤中两种共存污染物,通常伴随着水土流失引起面源污染,为揭示土壤中草甘膦和磷的保持、释放规律及其相互影响机制,通过等温吸附-解吸试验,研究了红壤和黄壤经草甘膦处理后对磷的吸附解吸规律以及磷对草甘膦在红壤和黄壤中吸附解吸行为的影响。结果表明,草甘膦作用下磷在供试土壤上的吸附行为可用Langmuir方程描述,红壤和黄壤对磷的吸附反应均是自发进行的吸热反应,两种土壤对磷的吸附量均随草甘膦浓度增加而下降。与对照相比,红壤经草甘膦处理后,对高浓度磷的解吸具有明显抑制作用,而黄壤磷解吸量在草甘膦作用下变化不明显,但解吸率随草甘膦浓度增加有所上升。此外,Freundlich方程对磷作用下草甘膦在供试土壤上的吸附行为拟合效果较好。未添加磷时,草甘膦在黄壤上的吸附量大于其在红壤上的吸附量,然而随着磷浓度增加,黄壤对草甘膦的吸附量减少。草甘膦在两种土壤上的解吸率均呈下降趋势,随着外源磷浓度增加,草甘膦在红壤上的解吸量和解吸率均显著降低,而不同磷处理下黄壤草甘膦解吸量变化一般在1.83~8.42 mmol·kg~(-1)之间,外源磷对草甘膦在黄壤上的解吸影响较小。以上研究表明,土壤中草甘膦和磷存在着吸附行为的竞争,草甘膦能够降低土壤对磷的吸附,同时磷也能够抑制土壤对草甘膦的吸附。     

水稻耐逆境种质创新研究十年回顾

十多年来,我们围绕中国南方水稻生产遇到的主要逆境因素,开展了水稻种质挖掘和创新研究。克隆或优化了耐旱基因AtDREB1A和CbDREB1A,抗除草剂基因Epsps~#、Pat~#和Mat~#,抗螟虫基因Cry2Aa~#和Cry1Ca~#,以及植酸酶-牛乳铁蛋白肽融合基因PhyLf。培育出了抗除草剂早籼稻新种质Bar68,抗2种除草剂水稻新种质EB7001S,抗除草剂、具植酸酶和抗菌肽活性的水稻新种质BPL9K,抗螟虫、抗除草剂的水稻新种质B2A4008S、B2A68、B1C893和B1C106,以及一些耐旱、耐盐、耐低温并抗除草剂的水稻新种质。从爪哇稻、籼爪交重组自交系、粳稻中筛选出了一些耐高温、耐旱性较好的种质资源。改良了华占、岳恢9113、Y58S、广占63S等骨干杂交稻亲本的褐飞虱和白叶枯病抗性。培育出了耐涝中间材料Sub-1BS。这些耐逆境新种质的创制,将为水稻耐逆境育种提供有力的技术支撑。