肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因快速克隆和鉴定

以提纯的肠炎沙门氏菌染色体ＤＮＡ为材料,在一对含有ＣＵＡＣＵＡＣＵＡＣＵＡ的特殊引物引导下,应用ＰＣＲ扩增出鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ,ｍ,约１．８ｋｂ左右大小,然后以ＵＤＧ法快速克隆到质粒ｐＡＭＰ１０中,转化第１宿主大肠杆菌ＴＧ１或大肠杆菌ＤＨ５α,在氨苄青霉素平板上筛选转化子,小量制备重组质粒ＤＮＡ,再转入第２宿主大肠杆菌ＬＣ－２ａ（ｈａｇ－,ｒｅｃＡ－）,所有转化子均出现动力。其中的一个克隆ｐＡＭＰ·ＧＭ经动力和动力抑制试验、血清学试验、鞭毛电镜观察及部分序列测定,均证实ｐＡＭＰ·ＧＭ中载有肠炎沙门氏菌鞭毛蛋白基因ｆｌｉＣｇ,ｍ。ｆｉｌＣｇ,ｍ克隆成功为寻求肠炎沙门氏菌防制新方法奠定了基础,研究中建立的快速克隆策略为广泛、深入地开展ｆｌｉＣ研究提供了便捷的新途径。     

牛生长激cDNA的表达与检测

利用低融点琼脂糖凝胶电泳，回收牛生长激素ｃＤＮＡ全序列，克隆于原核表达载体ＰＴ７７－７中Ｔ７启动子下游，转化大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α，经分离，酶切分析，获得６个牛生长有质粒ＰＴＧＨ１－６，选取其中两质粒ＰＴＧＨ１１－２，转化Ｅ．ｃｏｌｉＫ８３＝ｐＧ１－２，４２℃诱导３０ｍｉｎ，收集，破裂菌体，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测，于２２ＫＤ处有一特异性蛋白带，经ＳｈａｍａｄｚｕＣＳ９３０扫描测定，其表达量     

家蚕核多角体病毒Lef—1和DA26基因的克隆及部分序列分析

ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因分别位于ｅｇｔ基因的上游和下游．从ｐＵＡｃ－ｅｇｔ中分离出ＥｃｏＲＩ－ＸｂａＩ１．１ｋｂ的ｅｇｔ基因片段，进行缺口平移标记，获得探针。与ＢｍＮＰＶＤＮＡ经ＨｉｎｄⅢ酶切、电泳、转移至ＮＣ膜的ＤＮＡ进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交，发现ＢｍＮＰＶＤＮＡ的ＨｉｎｄⅢＤ片段呈阳性。从ＢｍＮＰＶ基因组中分离出１０．４ｋｂ的ＨｉｎｄⅢＤ片段，用ＥｃｏＲＩ酶切得到ＨｉｎｄⅢ－ＥｃｏＲＩ２．２ｋｂ、ＥｃｏＲＩ１．４ｋｂ和ＥｃｏＲＩ－ＨｉｎｄⅢ６．８ｋｂ３个片段，分别克隆于ｐＵＣ１９中，命名为ｐＵＨＥ２．２、ｐＵＥ１．４和ｐＵＥＨ６．８。经双链测序并与ＡｃＮＰＶ相关基因序列进行比较，发现ｌｅｆ－１基因被克隆于ｐＵＨＥ２．２中，ＤＡ２６基因克隆于ｐＵＥＨ６．８中。从所测定的ｌｅｆ－１和ＤＡ２６基因的启动子及５＇端部分序列来看，它们在ＡｃＮＰＶ和ＢｍＮＰＶ之间有极高的同源性。     

鸡传染性支气管炎病毒地方-分离株S1基因克隆和基因型鉴定

利用ＩＢＶ全长Ｓ１基因特异性引物,以纯化的３个标准株Ｍ４１、Ｈ５２、Ｔ和６个地方分离株（ＱＤ、ＺＺ、ＧＺ、ＧＪ、ＤＬ和ＹＣ）的基因组ＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出预期大小约１．７３ｋｂｃＤＮＡ片段,经ＢＡＭＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切插入到质粒ｐＵＣ１８中,并在大肠杆菌ＪＭ８３中实现了克隆。对６个分离株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物进行ＨａｅⅢＲＦＬＰ分析,表明ＱＤ、ＴＪ属于Ｍ４１基因型,ＺＺ和ＧＺ与Ｔ基因     

PEG法GUS基因在水稻原生质体及其愈伤组织中的瞬间表达初报

本文作者构建了ｐＸＭ１和ｐＧＣＹ６两个质粒，其中质粒ｐＸＭ，含有高赖氨酸基因和ＧＵＳ报告基因，质粒ｐＧＣＹ６则由裂解多肽Ｃｅｃｒｏｐｉｎ Ｂ基因和ＧＵＳ基因组成。这两个基因均以ＣａＭＶ３５Ｓ作为启动子，以ＮＯＳ作为终止子。经纯化的质粒ＤＮＡ以ＰＥＧ法导入４个水稻品种：８９－２、Ｌａｃｃａｓｉｎ、Ｃｙｐｒｅｓｓ、台北３０９细胞悬浮系的原生质休中，组织化学检测结果表明，ＧＵＳ基因在原生质体、愈伤组织及     

三种质粒DNA对不同大肠杆菌菌株转化率的比较

将重组ＤＮＡ导入细菌细胞是分子克隆的中心工作之一．转化率的高低直接关系到实验成败．使用３种质粒ｐＢＲ３２２、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ和ｐＵＣ１８，对３种大肠杆菌菌株进行转化，比较转化率，推荐使用１００ｍｍｌ／ＬＣａＣｌ２，ｐＨ６～８和４℃１２ｈ作为转化的优选条件。     

牛生长激素cDNA的克隆与序列分析

从平脑垂体中分离总ＲＮＡ，经ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）一纤维素柱纯化ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ技术扩增牛生长激素（ｂＧＨ）ｃＤＮＡ序列，长度为６２０ｈｐ，将ＰＣＲ产物克隆于ｐＵＣ１９Ｓｍａｌ位Ⅰ点转化大肠杆菌ＤＨ５α，经蓝白斑筛选，获得重组克隆，分离重组质粒，经限制性内切酶酶切分析后，进行序列分析。结果表明，一质粒中所含克隆片段为ｂＧＨｃＤＮＡ全序列，与国外所发表的ｂＧＨ核旮酸序列基本相同     

含有尿嘧啶DNA糖苷酶基因表达载体的构建

采用自行设计的带酶切位点的上下游引物,用ＰＣＲ技术,从大肠杆菌ＴＡＣＣ２３７４３的ＤＮＡ中,获得了含有编码尿嘧啶ＤＮＡ糖苷酶（ＵＮＧ）基因的ＰＣＲ产物,以该ＰＣＲ产物构建了重组克隆质粒ｐＧＥＭ／ＵＮＧ,ＤＮＡ序列分析结果确证其中含有完整的ＵＮＧ基因。利用该重组质粒,进一步构建了重组表面质粒ｐＢＶ／ＵＮＧ。     

Frankia共生固氮基因的分离与克隆

利用ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交方法，分离细枝木麻黄的Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ｃｃ０１的ｎｉｆ克隆ｐＣｃ１ＧＸ，赤杨内生菌株Ａｔ４的ｎｉｆ克隆ｐＡｔ１ＧＸ及沙棘的ＦｒａｎｋｉａＨｒ１８的ｎｉｆ克隆ｐＨｒ１８ＧＸ、ｐＨＲ１１－③ＧＸ。用基因功能互补法，从Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ａｔ４的基因文库中分离到二个可能可互补豌豆根瘤菌ｎｏｄ基因功能的克隆ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ，并制作了ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ的亚克隆，予进一     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ－２－ＵＫ分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

尿激酶原基因cDNA在BHK21细胞中的表达

将人尿激酶原（Ｐｒｏ－ＵＫ）基因ｃＤＮＡ分别插入到真核表达载体ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子和ｐＳＶ２－ｎｅｏ的ＳＶ４０启动子下游,构建了重组表达质粒ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ,分别将这两种表达质粒以脂质体载体法转染ＢＨＫ２１细胞。ＥＬＩＳＡ检测结果表明,ｐｃＤＮＡ３－ＵＫ和ｐＳＶ２－ＵＫ在哺乳动物细胞中能够表达,７２ｈ表达量分别为２８．７ｎｇ／ｍｌ和１３．５ｎｇ／ｍｌ。     

拟南芥ATLP-3基因在转基因烟草中的整合和表达

将拟南芥ＡＴＬＰ－３基因从质粒ｐＵＣＴＬ亚克隆到植物表达载体ｐＢＩ１２１中,得到了质粒命名为ｐＢＩＴＬ。被亚克隆到重组质粒ｐＢＩＴＬ的ＡＴＬＰ－３基因通过农杆菌ＬＢＡ４４０４介导法导入烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｏ Ｌ．ｖａｒ Ｇｅｘｉｎ Ｎｏ．１）。通过卡那霉素抗性筛选,得到１９株再生烟划植株。ＰＣＲ（用根据ＣａＭＶ３５ｓ启动子和ＮＯＳ终止子序列合成的引物）分析表明,ＡＴＬＰ－基因是在     

大麦黄矮病毒缺失复制酶基因植物表达载体的构建及转基因小麦的 …

以大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的ＲＮＡ为模板,采用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法,扩增出１１３４ｂｐ的缺失复制酶基因。将扩增的片段克隆到ｐＵＣ１９的Ｓｍａｌ位点上并进行了序列测定,获得正向插入的重组质粒ｐＵＣ１９Ｄ。以Ｋｐｎｌ从Ｘｂａｌ从ｐＵＣ１９Ｄ上切下此基因并插入质粒ｐＥｍｕ－ｍｃｓ－Ｎ得到植物表达载体ｐＰＰＩ８。应用花粉管通道法转化普通小麦品种陇鉴１２７、陕１６０和晋麦４７,通过卡那酶     

谷胱甘肽还原酶基因的表达载体构建及对马铃薯的转化

 利用 ｐＧＲ２０２和 ｐＢｉｎ１９两种质粒经过 ｐＢＩ ２２２的改建，含有 ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和 Ｎｏｓ终止子的 ＣＮ区ＤＮＡ片段与 ｐＢｉｎ１９的 Ｂｉｎ区 ＤＮＡ片段的不对称连接和目的基因 ＧＲ的 ｃＤＮＡ重组于真核表达双元载体三步亚克隆，筛选出一正向插入的谷胱甘肽还原酶基因的真核表达双元载体质粒ｐＢｉｎ－ＣＮ－ＧＲ。再利用此质粒转化的农杆菌ＬＢＡ４４０４进行马铃薯的遗传转化．并分化出卡那霉素抗性苗。过氧化物同工酶和酯酶同工酶谱带显示转化材料与对照之间存在显著的差异．表明转化材料的基因表达发生了变化。对转化影响因素的研究发现培养基的组成成分、选择压（Ｋｍ）添加浓度及加入时机是影响转化率的重要因素。     

鸡白细胞介素-2 cDNA克隆

用哺乳动物细胞表达克隆系统克隆了鸡ＩＬ－２ｃＤＮＡ。以ＣｏｎＡ（２０μｇ／ｍＬ）诱导ＳＰＦ鸡脾脏淋巴细胞,第２０小时收集细胞,提取ｍＲＮＡ,以ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＰｌａｓｍｉｄＳｙｓｔｅｍｆｏｒｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓ试剂盒合成ｃＤＮＡ,定向连结于穿梭质粒ｐＳＶ·ＳｐｏｒｔⅠ,构建ｃＤＮＡ文库。将文库分组提取重组质粒,转染ＣＯＳ－７细胞,表达ｃＤＮＡｓ。以淋巴细胞增殖试验检测表达产物ＩＬ－２活性。经过３轮筛选,获得１４个具有ＩＬ－２活性的克隆。选择其中４个进行酶切分析,结果显示这４个ｃＤＮＡ大小分别为１．５,１．０,０．８和０．８ｋｂ。     

玉米抗病相关侯选基因DNA片段克隆

根据已克隆的植物抗病基因的保守序列设计引物,对玉米ＤＮＡ进行扩增、克隆并对部分克隆进行了测序。测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ进行序列同源性比较分析。其中ｐＧＥＭ２－２３号克隆与玉米中乙醇脱氢酶基因（ａｄｈ１）在１５０４７～１５２７２ｂｐ处具有８５％同源性;ｐＧＥＭ２－２５号克隆与水稻ＢＡＣ库中１０号染色体的ＯＳＪＮＢａ００５５Ｐ２４克隆片段在６７００５－６７１５１ｂｐ处具有８２％同源性。推测ｐＧＥＭ２－２３克隆为－与乙醇脱氢酶有类似作用的抗病相关侯选基因的片断。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因农杆菌工程菌株的构建

采用固相亚磷酸三酯法人工化学合成了人胰岛素样生长因子－Ⅰ（ｈｕＩＧＦ－Ｉ）基因的４条寡核苷酸 片段，再通过片段１、２与３、４末端互补配对和Ｋｌｅｎｏｗ酶促补平及酶切连接成为完整的ｈｕＩＧＦ－ＩＤＮＡ片段，用 ＥｃｏＲ　Ｉ／ＰｓｔＩ酶切后克隆于 ｐＧＥＭ Ｔ－Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ，经测序证明所得 ＤＮＡ序列与设计的序列完全一致；选用植物 偏爱密码子校正了启始密码子ＡＴＧ下游的６个密码子，并在ＡＴＧ处增加Ｋｏｚａｋ序列后，插入ｐＢＩ１２１的ＢａｍＨＩ／ ＳａｃＩ位点，构建了以 ３５Ｓ为启动子的植物表达载体；以 Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲＩ切下“３５Ｓ－Ｋｏｚａｋ－ＩＧＦ－Ｉ－ＮＯＳ（ｔｅｒ．）”插入 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００之Ｈｉｎｄ ＩＩ／ＥｃｏＲ　Ｉ位点，构建成ｈｕＩＧＦ－Ｉ植物表达载体；通过ＣａＣｌ２直接转化法将表达载体导入农 杆菌ＥＨＡ１０５（Ｒｉｆ．ｒ），并以菌落原位杂交技术和 ＤＮＡ ｄｏｔ ｂｌｏｔ对重组农杆菌进行了筛选，所获得的重组农杆菌菌株为培育ｈｕＩＧＦ－Ｉ豆药用植物奠定了基础。     

遗传工程稻叶绿体psbA基因的克隆及结构分析

分别制备了遗传工程稻ＧＥＲ－１及其ＤＮＡ供体（慈利玉米）、ＤＮＡ受体（水稻湘早籼８号）的叶绿体ＤＮＡ（ｃｐＤＮＡ），对三者之间的多种限制性内切酶酶切图谱比较表明，ＧＥＲ－１的ｃｐＤＮＡ基本与ＤＮＡ受体水稻一致．进一步克隆了ＣＥＲ－１的ｐｓｂＡ基因，并构建其酶切图谱、测定其３′非翻译区（３′ＵＴＲ）序列，初步认为该基因的序列结构与水稻相同，从而排除了ＧＥＲ－１的性状变异是由其ｐｓｂＡ基因发生变化所致的可能．此外，对叶绿体ＤＮＡ的制备及酶切消化作了较深入的探讨     

一种简单快速分离鉴定少量质粒DNA方法

建立了一种以一定ＥＤＴＡ深度的ＮａＯＨＯ－ＳＤＳ溶液和ＢａＡＣ２溶液快速分离鉴定质粒ＤＮＡ的方法。该法是将菌落直接挑在ＮａＯＨ－ＳＤＳ溶液中，待细菌细胞壁破裂、质粒ＤＮＡＩ了出来后，按比例加入ＢａＡＣ２溶液、离心取上清液电泳、紫外灯下分析鉴定。与其他快速分离鉴定质粒ＤＮＡ的方法相比较，本法具有简单、可靠、省时、无染色体ＤＮＡ及ＲＮＡ污染、灵敏度高（可检出１ｍｍ左右直径的单个菌落听质粒ＤＮＡ）等优点     

含有IBV S1基因的昆虫杆状病毒表达载体的构建

以含有鸡传染性支气管炎病毒Ｈｏｌｔｅ株Ｓ１基因的重组质粒ｐＵＣ１８－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ和ｐＵＣ１８－Ｓ‘１．Ｈｏｌｔｅ为材料,分别构建了可表达ＩＢＶ Ｓ１基因的昆虫杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（含ＩＢＶ先导序列）,ｐＳＸＩＶＶＩ＾＋Ｘ３／４－Ｓ１．Ｈｏｌｔｅ（ＩＢＶ先导序列为融合短肽）,ｐＡｃＧＨＬ－Ｃ－Ｓ１,Ｈｏｌｔｅ。