草鱼呼肠孤病毒的检测方法

作者利用CIK敏感细胞系扩大培养病毒、采用蔗糖密度梯度离心法RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测草鱼呼肠孤病毒(GCRV),建立了GCRV实验室检验方法。     

草鱼呼肠孤病毒疫苗的研发与应用

正随着水产养殖产业的不断扩大,我国已成为世界上最大的水产品生产消费和进出口国家。2000年至2013年,水产养殖产量以每年5%~6%稳步增长,在2013年,中国水产养殖产量达4.542×10~7t,占全球水产养殖总产量的60%以上~[1]。根据世界粮农组织数据显示,2015年我国水产养殖总量达7.430×107 t。这些数据表明我国水产养殖业不仅保障了中国水产品的市场供应,也对世界水产品供     

草鱼呼肠孤病毒的研究进展

草鱼呼肠孤病毒(GCRV)是呼肠孤病毒科、水生呼肠孤病毒属的病毒中毒力最强的病毒,严重危害着我国淡水渔业的养殖。基因组由11条分节段dsRNA组成,编码11种结构多肽。GCRV能够合成内源性RNA聚合酶,在体外转录。总结了近20年来我国在GCRV形态结构、理化特性、培养特性、分子生物学以及预防治疗等方面的研究成果,提出了GCRV的重要酶类作为RNA干涉靶基因的思路。由于中和效价最高的蛋白基因M6在毒株中具有相对保守性,初步确认了基因工程亚单位疫苗开发的可行性。     

草鱼呼肠孤病毒减毒的研究

草鱼呼肠孤病毒GCHV－892野毒株在PSF细胞中连续传代时，于培养液中加入一定浓度的桉液，传至19代已达减毒目的。继代至29代，其减毒效果保持稳定；传至27代后不再加入桉液，传代至37代，其减毒效果仍保持稳定不变。致弱病毒对草鱼的安全性好，免疫原性强。用该弱毒株制备的弱毒疫苗免疫草鱼后，草鱼的成活率和免疫保护率均达100％。因而作者认为桉液是草鱼呼肠孤病毒的一种良好减毒剂。经桉液减毒的GCHAV－892是一株可应用于生产上制备弱毒疫苗的良好弱毒株。     

草鱼呼肠孤病毒VP7基因核酸疫苗的构建及免疫效果

将草鱼呼肠孤病毒( GCRV)外衣壳蛋白VP7双基因(约0.9 kb)及团头鲂的β-肌动蛋白启动子(约0.56 kp)经扩增并鉴定正确后,克隆至基因转移载体pFastBacTM Dual中,获得重组质粒pFastBac-β-VP71 -VP72,以此研究草鱼免疫实验及免疫效果.重组质粒按10、30、60μg分为3组,同时设30 μg空载体组及对照组.于免疫后第14、21、28、49天通过RT-PCR检测VP7的转录水平、间接凝集反应测定抗体水平及攻毒试验检测免疫保护效果.结果显示,pFastBac-β-VP71 -VP72导入鱼体后,VP7基因在β-肌动蛋白启动子的驱动下持续表达,至第49天仍能检测到目的基因的转录;各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第21天达到最高,攻毒后10、30、60 μg核酸疫苗免疫组死亡率分别为0％、0％、5％,而空载体组和对照组分别为30％和100％,表明pFastBac-β-VP71-VP72作为核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果.研究结果为草鱼呼肠孤病毒核酸疫苗的研发与生产应用奠定了基础.     

草鱼出血病病原—鱼呼肠孤病毒(FRV)核酸特性的研究

<正> 本协作组曾报道从草鱼出血病病鱼组织中首次分离出一种直径约为60nm的球形病毒,并证实这一病毒为草鱼出血病的病原。随后,做了其精细结构的观察与分析。本文对该病毒的核酸基本特性进行了研究。根据我们以前和本文报道的     

草鱼呼肠孤病毒的致病机制及抗病毒新对策

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引发草鱼病毒性出血病,是危害性最大的草鱼病原体。该病毒基因组由11条双链RNA组成,共编码7种结构蛋白和5种非结构蛋白。报告总结了呼肠孤病毒在基因表达、蛋白质合成、细胞凋亡、细胞融合、细胞膜渗透、干扰素分泌、细胞分裂以及细胞压力小体等方面与宿主细胞相互作用的生物学研究进展;论述了蛋白酶抑制剂、RNA干扰(RNAi)机制、干扰素诱导素、GCRV干扰颗粒及小分子化合物等抗病毒策略的分子作用机制。报告预测基于中草药的免疫增强剂和口服化基因工程抗病毒疫苗将是最容易被市场化的两种绿色抗草鱼出血病药物。     

草鱼呼肠孤病毒湖州分离株的分离及鉴定

2008年6月从湖州某患病草鱼池塘采集草鱼出血病疑似病样,将除菌过滤后的患病鱼肝、脾、肾组织滤液,注射健康的8～10 cm的草鱼鱼种.5d后草鱼开始发病,且症状与原发病症状一样,死亡率为57%,对照组未有死亡.将无菌处理的病样滤液接种草鱼肾细胞(CIK),连续接5代均出现明显的细胞病变(CPE),并与草鱼呼肠孤病毒参考株所产生的CPE一致.该株病毒的TCID50为10-8/0.1ml.内脏组织经超薄切片,电子显微镜观察,发现组织内有大量的病毒颗粒,大小均一,近似球形,直径约70～75 nm.理化鉴定表明,氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比并没有多大变化,说明该株病毒对氯仿和乙醚有一定的抗性.经草鱼呼肠孤病毒特异性的RT-PCR检测,获得阳性的目的片段,测序的结果与草鱼呼肠孤病毒相应序列的同源性达99%以上.上述鉴定结果表明所分离的病毒为草鱼呼肠孤病毒,将其命名为HZ2008.     

草鱼出血病灭活疫苗注射治疗草鱼出血病试验

本试验表明，在鱼塘条件、饲养管理和防病技术等基本相同的情况下，注射免疫试验塘比对照塘平均提高草鱼成活率１８．６％，每亩增产５０．８５ｋｇ。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株FQ-PCR检测方法的建立及应用

草鱼出血病是危害中国淡水养殖最为重要的病害之一,其病原为草鱼呼肠孤病毒(grass carp hemorrhagevirus,GCRV),其中,HZ08株是当前引起草鱼出血病的主要流行毒株。为建立一种快速、灵敏、特异的草鱼呼肠孤病毒主要流行株检测方法,本研究利用草鱼呼肠孤病毒HZ08株S7基因保守区,设计了一对能特异性扩增154 bp片段的引物和TaqMan探针,用含有S7基因全长的重组质粒PAVX1-S7作为标准品,构建质粒拷贝数与CT值的标准曲线,并对该方法的特异性、可重复性、敏感度进行评价。结果显示:标准曲线在6.0×1010～6.0拷贝数之间有很好的线性关系(r=0.999);实时荧光定量PCR最少可检测到6个阳性质粒,有较高的敏感性;试验内及试验间变异系数分别为0.82%与0.41%～0.52%,重复性强;对水生动物其他病毒均无扩增反应,具有很好的特异性。应用该方法对采集的32份草鱼出血病样品进行检测,其中28份为阳性,而以常规RT-PCR检测同样的样品,仅23份为阳性。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒流行株实时荧光定量PCR检测方法在特异性、灵敏度、重复性方面具有较好的测试结果,在GCRV的快速检测和病毒初步定量中应用前景乐观。     

注射草鱼出血病疫苗免疫效果的观察报告

草鱼出血病不仅严重威胁着当年鱼种，而且会激发细菌性“三病”的发生，这方面已有许多报道。一直以来，草鱼已成为我区池塘养殖的当家品种，但草鱼容易发病，每年因出血病和细菌性“三病”的发生，使草鱼的成活率仅有40%-50%，有的甚至只有10％左右，给我区的渔业生产带来严重     

草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用

针对草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)各类型毒株的保守区域分别设计3对引物,优化反应条件和体系,建立了草鱼呼肠孤病毒三重RT-PCR检测方法,通过PCR扩增分别获得大小约为530 bp、297 bp和196 bp的DNA片段。进一步分析表明,该检测方法具有良好的敏感性、特异性和稳定性,可以检测Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型核酸最低量分别约为260、190与230拷贝的病毒量,且某一类型的引物只能检测到同一类型的GCRV。用建立的多重RT-PCR方法对2008—2011年采集自江西、广东、湖北、浙江、重庆、四川、福建等地的草鱼(Ctenopharyngodonidellus)主养区的86份草鱼出血病样品进行检测和初步流行病学分析。结果表明,Ⅰ型阳性率为9.3%,Ⅱ型阳性率为45.3%,Ⅲ型阳性率为2.3%,Ⅰ型和Ⅱ型混合感染阳性率为5.8%,Ⅱ和Ⅲ型混合感染阳性率为2.3%,其他类型的混合感染未检测到。表明目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型。本研究建立的GCRV三重PCR检测方法可以特异性的检测各种类型的草鱼呼肠孤病毒,且具有较高的敏感性;利用该方法进行草鱼出血病初步的流行病学分析表明,目前主要流行的草鱼呼肠孤病毒为Ⅱ型,不同毒株类型混合感染的现象也普遍存在。本方法的建立旨在对草鱼出血病的快速诊断和分子流行病学调查提供实用的可操作手段。     

草鱼呼肠孤病毒JX-0902株的分离和鉴定

收集江西南昌地区患典型草鱼出血病的病鱼组织,进行超薄切片电镜观察,结果显示,在脾、肾样品中发现大量病毒颗粒,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)相似。取病鱼肌肉、内脏研磨,组织液经离心、过滤除菌后进行鱼体人工感染试验和细胞感染实验,结果发现,人工感染试验鱼出现死亡,且具有典型出血症状;组织滤液感染草鱼肾细胞系(CIK)细胞后,盲传6代未观察到典型细胞病变效应,但感染细胞固定后经超薄切片电镜观察,细胞质内有大量病毒存在,与病鱼组织切片观察到的病毒形态一致。SDS-PAGE结果进一步揭示,新分离病毒株(暂命名JX-0902)基因组由11条dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征,但基因组带型与GCRV 873株存在差异,而与HZ08株接近。根据GenBank上已提交的草鱼呼肠孤病毒S6序列(GQ896337)设计特异引物,以JX-0902株的cDNA作为模板,可扩增出特异性条带。基于S6序列的聚类分析结果显示,JX-0902与GCRV HZ08株、GD108株S6同源性高达98%、99%,该分离株应为草鱼呼肠孤病毒。     

草鱼呼肠孤病毒NS79蛋白多克隆抗体制备

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)隶属于呼肠孤病毒科,水生呼肠孤病毒属,该病毒引起草鱼鱼种出现严重的出血病。GCRV基因组由11个分节段的双链RNA构成,NS79是由草鱼呼肠孤病毒GCRV-HN14株S4节段编码的蛋白。根据草鱼呼肠孤病毒编码NS79的c DNA序列,经PCR扩增NS79基因部分片段,将目的基因片段插入原核表达载体p ET-32a(+),构建重组表达质粒NS79E-p ET-32a,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,表达出来融合蛋白分子量约为35k Da,表达的重组蛋白用Ni-IDASefinose(TM)树脂纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,采用ELISA法测定其效价大于1:64000。这些结果为NS79蛋白功能的深入研究提供基础。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株的分离与鉴定

从浙江省湖州地区采集发病草鱼(Ctenopharyngodon idellus)样本中,取症状明显病料的肝、脾、肾组织,经过滤除菌处理后接种草鱼肾脏细胞(CIK).盲传8代,CIK细胞未出现明显细胞病变,但感染细胞固定后经电镜观察发现,细胞质内有大量病毒聚集,病毒无囊膜,近球形,直径约70 nm,形态与已报道的草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)相似.将病毒提纯后分别经DNA酶、RNA酶和绿豆核酸酶消化,证实为双链RNA(dsRNA)病毒.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果显示,病毒基因组由11个dsRNA组成,呈现水生呼肠孤病毒基因组典型特征.采用RNA水平3味端加接头的方法获得了S6节段的全长序列,测序结果表明,S6由2 030个核苷酸组成,推测其编码一个分子量约为68.4 kD的蛋白.聚类分析结果显示,该病毒为水生呼肠孤病毒,但在氨基酸水平上与草鱼呼肠孤病毒代表株873株的差异较大,同源性为33%,提示该病毒为一株新型的草鱼呼肠孤病毒.本研究旨在为草鱼出血病防治方法的深入研究奠定基础.     

草鱼呼肠孤病毒AH528株全基因组特征及进化分析

草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)引起的严重危害1~2龄草鱼的一种传染性疾病。本研究从安徽合肥地区患典型草鱼出血病的病鱼组织中分离到1株新的GCRV致病株,暂命名为GCRV-AH528。鱼体人工感染实验结果显示,实验鱼出现典型的出血病症状:体背发黑,鳍基部、腹部、口腔、鳃丝、肠道充血发红。全基因组特征分析显示,GCRV-AH528由11个双链RNA节段组成,节段大小在1027~3925 bp之间,AT平均含量为50.2%,GC平均含量为49.8%。与其他GCRVⅡ型毒株相比,L1节段在701~702位置缺少3个核苷酸(TAT),少编码1个酪氨基;M4节段出现突变,含2个开放阅读框,编码2个非结构蛋白NS9和NS69。所有节段两端均含有6 bp保守的末端核苷酸序列5'-GUAAU/CU…UU/GCAUC-3';另除L1、M6节段外,其余9个节段均在编码区两侧发现5~9 bp的颠倒互补序列。GCRV-AH528与其他呼肠孤病毒核苷酸平均相似度在37.1%~98.1%之间;编码蛋白平均相似度在24.3%~98.3%之间。基于VP1蛋白的聚类分析结果显示,该病毒属于水生呼肠孤病毒属,在氨基酸水平上与典型株GCRV-873株的进化关系较远。本研究结果表明,该毒株为一株新的草鱼呼肠孤病毒Ⅱ型致病株。     

基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒TaqMan Real-Time PCR检测方法的建立及应用

为了建立和应用可检测基因Ⅰ型草鱼呼肠孤病毒(GCRV)的荧光定量检测方法,实验根据基因Ⅰ型GCRV的S6保守序列,分别设计扩增目的条带661 bp普通引物(P1、P2)、扩增目的条带159 bp荧光定量引物(F1、F2)和一条探针;同时构建含有目的片段的PVAX1-S6作为标准质粒,10倍梯度稀释构建质粒拷贝数与Ct值的标准曲线(Y=-3.389X+38.076)。结果表明,此方法在3.9×107~3.9×101拷贝/μL之间相关性较好,R2为0.992,最小检测量为4拷贝/μL;且与基因Ⅱ型、Ⅲ型GCRV以及其他病原核酸无交叉反应。运用该方法检测16份草鱼出血病疑似样品,阳性结果为4份;而普通PCR检测仅2份显示阳性。本研究建立了针对基因Ⅰ型GCRV的荧光定量检测方法,具有高效、特异、灵敏、可重复性强的优点,适合于目前基因Ⅰ型GCRV的临床快速检测和病毒定量分析。     

草鱼呼肠孤病毒HZ08株抗体IPMA检测方法的建立及应用

为建立一种检测草鱼呼肠孤病毒HZ08株(HZ08)抗体的免疫学方法,本实验以接种HZ08病毒的细胞培养板为抗原板,以免疫弱毒疫苗的草鱼血清为抗体,通过反应条件优化,建立了检测GCRV HZ08血清抗体的免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)方法,并对该方法特异性、敏感性、重复性、与ELISA检测结果的符合率及对临床血清样品的检测效果等进行了验证。结果显示,HZ08株种毒按照1×103拷贝/μL浓度接种后72h固定,HRP-Ig G二抗1∶1000稀释,待检血清1∶100稀释时效果最佳;该IPMA方法与草鱼阴性血清、免疫细菌三联疫苗的草鱼血清、感染GCRV JX0901(GCRVⅠ型)的草鱼血清无交叉反应;GCRV HZ08株阳性血清稀释至1∶800时仍能检出;批内和批间重复性实验显示,该方法具有良好的重复性;符合性实验结果显示,该IPMA方法与ELSIA方法的阳性和阴性符合率分别为95.7%和87.5%;用建立的IPMA方法检测草鱼出血病弱毒疫苗免疫草鱼,免疫2周后抗体水平达到峰值;对现地送检的126份草鱼血清样本进行检测,平均检出阳性率为72.2%。研究表明,建立的HZ08株IPMA方法特异性强、重复性好、敏感性高,为GCRVⅡ型的流行病学调查、疫苗免疫效果评价及抗原抗体检测提供了一种有效的检测手段。     

草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR检测方法的建立

利用RT-PCR技术扩增出草鱼呼肠孤病毒(GCRV)VP6蛋白编码区长度为1 250 bp的片段,克隆到pEGFP-N1载体上,构建重组质粒pEGFP-N1-VP6。经PCR鉴定确认正确后,以10倍梯度稀释pEGFP-N1-VP6重组质粒,作为标准模板进行TaqMan real-time PCR扩增,制作标准曲线,建立了草鱼呼肠孤病毒的荧光定量PCR检测方法。检测结果显示,标准曲线的相关系数(R²)达到0.998 09,斜率为-3.373;对初始模板定量检测的范围为1×10¹～1×10⁶ copies/μL;特异性试验结果表明,该方法可特异性地检测出草鱼呼肠孤病毒,而对鲤春病毒血症病毒(SVCV)、传染性造血器官坏死症病毒(IHNV)无检测信号。本研究建立的草鱼呼肠孤病毒Taq Man real-time PCR方法灵敏度高、特异性强,可进行定量分析,对草鱼出血病快速诊断与病毒病原定量检测有重要意义。     

两株草鱼呼肠孤病毒江西株的分离与鉴定

对从江西省南昌县莲塘镇的患病草鱼鱼种池塘采集到草鱼出血病疑似病样材料分离出的两株病毒株进行了鉴定。结果显示:用除菌过滤后的患病鱼肝脏、脾脏、肾脏组织浆滤液腹腔注射感染8～10 cm健康草鱼鱼种,5 d后试验鱼发病,可复制出自然发病症状,死亡率达50%以上,对照组未有死亡。用病样滤液接种草鱼肾细胞系(CIK),可产生细胞病变效应(CPE),病毒的TCID50分别为10-8.3/0.1 mL和10-8.0/0.1 mL。理化特性研究结果显示:氯仿、乙醚处理组病毒的感染力和对照组相比变化不显著。病毒基因组RT-PCR反应可扩增出目的片段,序列测定与分析结果表明,其与GenBank中GCRV(登录号为AF403392,AF239175)相应序列的同源性达99%以上。