日本结缕草感染立枯丝核菌初期NCED基因的表达及响应分析

以转录组数据为基础,筛选并克隆出"Zenith"品种日本结缕草NCED基因片段。通过荧光定量PCR手段获得NCED基因在立枯丝核菌根部侵染初期(0~48h)表达变化模式。结果表明,胁迫处理后NCED基因表达量比未感染时均升高,且随时间变化呈现先上升后下降的趋势,在36h大量表达达到最高。进一步检测植物根部内源ABA水平发现,0~48hABA水平变化趋势与NCED基因表达模式趋势一致,并在48h之后趋于平衡。结果表明,该基因调控植物内源ABA的合成并进一步参与植物抗病机制。本研究为探究结缕草的抗病分子响应机制及育种方面的研究提供理论依据。     

日本结缕草耐盐基因ZjbHLH106的克隆及序列分析

bHLH106隶属于Basic helix-loop-helix(bHLH)超家族成员,是一类耐盐相关的转录因子。以日本结缕草为研究对象,通过将拟南芥AtbHLH106与日本结缕草基因组的同源序列比对,鉴定到了日本结缕草ZjbHLH106基因(Zjn＿sc00014.1.g08160.1.sm.mk),利用RT-PCR法,从日本结缕草中克隆出该基因序列。结果显示,ZjbHLH106基因编码区(CDS)的长度为747 bp,有2个外显子和1个内含子;蛋白序列包含了1个典型的bHLH结构域;启动子区域包含了多种生物进程相关转录因子靶位点,包括生物胁迫、非生物胁迫、生长素调控等;ZjbHLH106基因响应盐胁迫诱导,参与了结缕草盐胁迫相关的生物学反应。对ZjbHLH106基因的克隆和研究可为日本结缕草耐盐相关的研究提供理论依据。     

以基因枪法转化日本结缕草获得转基因植株

将含有DREB1A和gus基因的双基因载体质粒包裹在金粉上,以基因枪轰击日本结缕草胚性愈伤组织,以gus基因的瞬时表达研究日本结缕草基因枪转化参数.结果表明, 在1 100 psi压力下6 cm的轰击距离、每皿轰击2次的转化效果最好,而金粉和质粒用量对转化效率影响不显著;经过筛选和再生培养,检测到gus基因的稳定表达,并获得日本结缕草潮霉素抗性株系,PCR-Southern杂交证实外源DREB1A基因已整合到日本结缕草基因组中.      

不同土壤水分条件下断茎处理对克隆植物结缕草表型可塑性的影响

通过断茎处理,研究在不同土壤水分条件下克隆植物结缕草的水分生理整合作用对表型可塑性的影响。结果表明,在土壤水分均质和异质环境下,与断茎处理相比,保持匍匐茎的连接对结缕草的形态学指标均有促进作用;断茎处理均降低了分枝强度;在土壤水分异质和均质环境下,在结缕草克隆植株内存在水分生理整合,而且整合的方向既有从基部到梢部的向顶传输,又有从梢部向基部的向基传输,即水分传输是双向的。     

克隆整合对结缕草与狗牙根种间竞争的影响研究

以结缕草(Zoysia japonica Steud.)为研究对象,选取狗牙根[Cynodon dactylon (L.)Pars.]为竞争种,在盆栽条件下,通过切断或保持其基端分株与先端分株间的匍匐茎连接,研究了克隆整合对结缕草先端分株生长及竞争力的影响.结果表明,克隆整合显著提高了结缕草先端分株的分株数、根数量和生物量,并降低了其对叶的生物量投资.种间竞争显著降低了结缕草的生长,并显著提高了根生物量分配.当具有相似克隆生长习性的狗牙根的竞争存在时,克隆整合作用不能提高结缕草先端分株的竞争力,狗牙根的存在较强地抑制了结缕草生长.     

低温胁迫对日本结缕草叶绿素代谢的影响

[目的]日本结缕草是具有众多优良性状,被广泛应用的暖季型草坪草.通过对其叶绿素合成及降解的研究,探究日本结缕草秋冬季节在我国北方地区较早出现叶片脱绿现象的内源机理.[方法]对日本结缕草进行14h光照(4℃)、10h黑暗(2℃)的循环低温处理,并对叶绿素、叶绿素合成与降解途径中重要酶的活性、中间产物含量以及叶绿素代谢相关...     

褐飞虱R2D2基因的克隆及表达分析

R2D2蛋白广泛分布于各种生物体中,R2D2是si RNA介导的RNA干扰途径中的关键组分。R2D2含有一个串联的ds RNA结合功能域,与Dcr-2在体内形成杂合二聚体,在si RNA装载入RISC时发挥作用。本研究克隆了褐飞虱(Nilaparvata lugens St覽l)R2D2基因(NLR2D2),结果表明,NLR2D2基因全长1 673 bp,含有一个长1 005 bp的开放阅读框,编码335个氨基酸。NLR2D2蛋白与蚂蚁亲缘关系最近。利用q RT-PCR检测NLR2D2基因在褐飞虱不同发育阶段的表达,发现NLR2D2转录本在褐飞虱的所有发育阶段都有表达,在1龄若虫中表达量最低,随着生长发育表达量逐渐升高。NLR2D2基因的序列特征和表达谱非常保守,为其功能的分析提供了信息。     

传染性法氏囊炎病毒部分VP2基因的克隆与原核表达

传染性法氏囊炎病毒(IBDV)是侵害雏鸡和青年鸡的重要病原,病毒VP2蛋白是主要保护性抗原。为研究不同毒株VP2基因的变异及其抗原表位特点,作者克隆、表达和鉴定了VP2基因。首先应用SPF鸡胚接种和鸡胚成纤维细胞培养法复制病毒,并以自行设计的1对引物,从中扩增出987 bp的VP2片段并进行鉴定。测序结果表明,国内不同毒株VP2高变区序列同源性达99%以上。将其部分片段插入载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转入大肠杆菌后用IPTG诱导表达。经检测,在SDS-PAGE中可见大小为44 400的融合蛋白。     

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因在乳酸乳球菌中的异源表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏好性,在不改变编码蛋白的基础上,优化设计并合成枯草芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C基因,将其与大肠埃希菌 乳酸乳球菌穿梭质粒pAMJ399连接,构建重组质粒pAMJ399 PIPLC,并电转化至乳酸乳球菌中进行诱导表达。SDS PAGE分析显示：重组蛋白以可溶性蛋白的形式分泌于胞外,分子质量约35 ku,与预期蛋白大小一致。重组蛋白在PI 李斯特氏菌显色平板上显现明显的乳白色晕圈,证明重组蛋白具有酶活性,磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C（PI PLC）在重组乳酸乳球菌中成功获得表达。通过优化培养条件,以2%转接量,在含有1%红霉素抗性的GM17液体培养基中,于32 ℃静止培养24 h,测得培养基上清液中PI PLC的浓度为1.092 μg·mL-1。     

甘蔗转化酶抑制子(SoInvInh1)基因克隆和表达分析

采用cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以甘蔗未成熟茎cDNA为模板克隆转化酶抑制子,命名为SoInvInh1,GenBank登录号KF575175。SoInvInh1基因的cDNA序列全长为678bp,3′-UTR长146bp。开放阅读框长531bp,编码176个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.09ku和8.52。SoInvInh1不含内含子序列。预测该蛋白N端具有1个信号肽和跨膜结构,19—172位氨基酸是PMEI蛋白的保守结构域。不同物种间InvInh蛋白氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点。荧光定量PCR分析表明在甘蔗茎、叶、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh1基因表达。在甘蔗生长的不同时期,SoInvInh1在叶中表达无明显规律。而在工艺成熟期和生理成熟前期SoInvInh1整体上表现为幼茎中基因表达量高,而老茎中基因表达量低,表明茎中该基因可能与酸性转化酶活性相关。     

甘蔗蔗糖转运蛋白SoSUT2基因克隆和表达分析

为分析甘蔗SUT家族基因新成员的序列特征和基因表达模式,采用cDNA末端快速克隆技术,以甘蔗GT28未成熟茎cDNA为模板克隆蔗糖转运蛋白基因,命名为SoSUT2-h1,GenBank登录号KF808330。该基因的cDNA序列全长为2 132bp,开放阅读框长1 749bp,编码582个氨基酸,预测分子量和等电点分别为61.80ku和6.17。SoSUT2-h1蛋白具有12个跨膜结构。该蛋白具有保守的蔗糖转运蛋白功能域,属于MFS蛋白家族和GPH(蔗糖/H+共转运体)超家族中的一员。荧光定量PCR表明在甘蔗叶、花序、芽、茎和根中都能检测到SoSUT2基因表达,其中在芽中表达量最高,花序次之,而在根中表达量最低。在甘蔗工艺成熟期,SoSUT2基因表达量与节间蔗糖含量呈正相关性,推测该基因可能参与调控甘蔗节间蔗糖的积累。     

瘤背石磺磷脂酶C基因的克隆及在不同声波刺激下的表达

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)是一类与膜蛋白相关的酶,在信号转导途径中起作用。栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)能够感知当地的潮汐规律,为了探究瘤背石磺中磷脂酶C在潮汐感知中的作用和分子机制,本实验以瘤背石磺神经环为实验材料,利用RACE-PCR技术得到了其cDNA全长,并进行生物信息学分析和实时荧光定量PCR实验。结果显示,瘤背石磺PLC基因的cDNA全长为2 578 bp,开放阅读框1 881 bp, 5′非编码区337 bp, 3′非编码区340 bp,并且在末端存在AATAAA加尾信号,共编码627个氨基酸;氨基酸序列比对结果显示,瘤背石磺PLC氨基酸序列与福寿螺的磷脂酶C样蛋白2氨基酸序列匹配度最高,与传统形态学的分类相吻合。在实验室内模拟潮汐产生的音波来刺激瘤背石磺,使用实时荧光定量PCR检测OrPLC基因在瘤背石磺神经环中的表达,结果显示:OrPLC在刺激声波频率为40 Hz和70 Hz的时候表达量基本稳定;声波频率为160 Hz和310 Hz时表达量较低;在声波频率为220 Hz和280 Hz时,处于高表达的状态,说明该基因在瘤背石磺的低频感知中发挥重要作用。该实验为进一步了解瘤背石磺潮汐感知功能研究奠定了理论支撑。     

红麻TIR1基因克隆及其表达载体构建

[目的]分析红麻运输抑制剂响应蛋白1(TIR1)基因在不同组织和不同发育时期花药中的表达情况,并构建其超量表达载体和干扰载体,为研究该基因在雄蕊发育中的调控功能打下基础.[方法]根据红麻花药转录组数据,利用生物信息学方法,克隆TIR1基因cDNA序列,实时荧光定量PCR(qPCR)分析TIR1基因在红麻保持系722B和不育系722A根、茎、叶及不同发育时期花药中的表达情况,并构建超量表达载体和干扰载体.[结果]TIR1基因的开放阅读框(ORF)为1761 bp,编码586个氨基酸(GenBank登录号KY613992).qPCR检测结果显示,与不育系722B相比,不育系722A TIR1基因在四分体期花药中呈显著下调表达(P<0.05,下同),在茎和双核期花药中呈显著上调表达,在单核期花药中极显著上调表达(P<0.01);而在根和叶中,保持系722B和不育系722A中TIR1基因表达水平差异均不显著(P>0.05).超量表达载体pBI121-GFP-TIR1和干扰载体pART27-pK-Tz-Tf构建成功.[结论]红麻TIR1基因编码一个富含亮氨酸重复的F-box蛋白.红麻不育系722A的单核期花药TIR1基因表达较保持系722B极显著上调表达,可能与花药败育有关.构建的超量表达载体和干扰载体,可用于红麻TIR1基因功能及其与雄蕊发育的关系研究.     

人α-乳白蛋白质基因的克隆及其在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达

采用PCR方法从人类基因组DNA中扩增hα-LA基因,将扩增产物克隆到pMD19-T载体,并进行测序验证。通过双酶切法将测序正确的hα-LA亚克隆至真核表达载体pCEP4,构建真核表达载体pCLA并进行酶切鉴定。用脂质体法将pCLA转染至奶山羊胎儿成纤维细胞中,用RT-PCR法检测细胞中hα-LA基因mRNA的表达,用Western-blotting法检测培养上清液中hα-LA蛋白质的表达。结果显示:克隆的hα-LA基因序列完全正确,pCLA酶切鉴定正确,RT-PCR检测到转染细胞中hα-LA基因mRNA的表达,Western-blotting检测到转染细胞培养上清液中hα-LA蛋白质。表明所克隆的hα-LA基因组DNA能够在奶山羊胎儿成纤维细胞中正确转录和翻译。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白基因的克隆及表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计引物,用RT-PCR扩增出PRRSV甘肃株的核衣壳蛋白(N)基因,将N基因克隆至pGEM-T easy载体上,获得含N基因的阳性重组质粒pGEM-T easy-N.对质粒中的插入片段进行测序,应用DNAStar分析所测序列与GenBank中已登录的PRRSV毒株的同源性,再将其亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达载体pGEX-4T-1-N,转化E.coliBL21(DE3)细胞,用SDS-PAGE检测表达产物,并对其进行纯化.结果表明:PRRSV甘肃株N基因核甘酸序列与PRRSV-VR2332株的同源性为93.3%,与欧洲LV株的同源性为66.1%;构建的重组表达载体在大肠杆菌中获得了成功表达,表达产物为40ku的可溶性融合蛋白.     

细胞质雄性不育相关基因orf224的克隆及其植物表达载体的构建

利用 PCR技术从油菜 Polim a不育系中扩增出细胞质雄性不育相关基因 orf 2 2 4 ,并将其克隆到p GEM- T Easy载体上得到重组质粒 p GEMORF。在此基础上 ,用限制性内切酶将 orf 2 2 4基因从质粒 p GEMORF上切下 ,连接在 p BI12 1质粒的 Ca MV 35 S启动子和 NOS终止子之间。经 PCR和酶切鉴定 ,得到了 orf 2 2 4基因的植物表达载体 p BIORF