miR395分子进化特性及其在龙眼早期体胚发生中的表达分析

【目的】研究miR395的分子进化特性及其在龙眼早期体胚发生中的表达分析。【方法】通过龙眼miRNA文库、转录组数据库和miRBase数据库,得到所有植物miR395家族成员成熟体和前体序列,对其进行序列比对及进化分析、保守性分析、前体二级结构预测、潜在靶基因预测,对龙眼miR395a在龙眼早期体胚发生(SE)阶段的表达模式进行分析。【结果】龙眼miR395家族包含5条前体序列和2条成熟体序列。Mfold预测分析发现,龙眼pre-miR395序列均能形成稳定的发卡结构,其最小折叠自由能ΔG在-44.70～64.80 kal·mol-1,提示与序列长度没有显著相关性。其次,保守性分析显示,植物pre-miR395两端序列较保守,而中间序列不保守;系统进化分析提示,龙眼pre-miR395家族与脐橙、葡萄和苹果的亲缘关系更近。psRNAtarget预测显示,龙眼miR395调控的潜在靶基因主要包含富含亮氨酸重复受体蛋白激酶LRR-RLKs、ATP硫酸化酶APS1、蛋白磷酸酶PP2C、前体RNA蛋白质TSR1同系物TSR1、酮酯酰CoA硫解酶KAT2和EH结构域蛋白EHD1等6个,且都是以裂解靶标的方式进行调控。qRT-PCR分析表明,在龙眼早期体胚发生阶段,miR395a呈上调趋势,且miR395a与APS1呈显著负相关。【结论】龙眼miR395与其他植物miR395功能具有高度保守性和物种特异性,同时龙眼miR395a上调表达可能促进龙眼球形胚的形态建成。     

龙眼体胚发生早期miR166初级体的克隆与表达分析

为了解龙眼miR166初级体基因Pri-miR166 S53结构特点及其前体和成熟体在龙眼体胚发生早期的表达模式,采用SMART~(TM) RACE试剂盒和PCR扩增技术克隆龙眼体胚早期miR166基因的初级体(Pri-miR166 S53),确认其转录起始位点,并预测其含有的潜在ORF;利用龙眼基因组数据库提取其启动子序列,预测其含有的顺式作用元件;用实时荧光定量PCR对龙眼体胚发生早期及不同激素处理下的胚性愈伤组织中miR166基因的前体(Pre-miR166 S53)和成熟体(miR166a.2)表达模式进行分析。结果表明:获得长317 bp的Pri-miR166 S53基因初级体序列,对其进行翻译,得到一条长13个氨基酸序列的miPEP(MLCFVDALFLIST)。利用生物信息学软件分析Pri-miR166 S53基因的启动子序列发现,除了具有TATA/CAAT-box外,还含有生长素、脱落酸、乙烯、水杨酸、茉莉酸甲酯及spl、HSE等特异作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,在2,4-D调控的龙眼体胚发生早期过程中,从胚性松散型愈伤组织发育到球形胚的过程中,Pri-miR166 S53基因的前体pre-miR166 S53和成熟体miR166a.2都表现为下调趋势;而在无2,4-D调控的龙眼体胚发生早期中,pre-miR166 S53和miR166a.2表达模式不同。此外,pre-miR166S53随ABA和乙烯处理浓度升高呈下调表达,而对不同浓度2,4-D处理无应答;miR166a.2随2,4-D、ABA处理浓度升高呈下调表达,而在乙烯处理下呈上调表达。上述研究结果提示miR166前体和成熟体在对外源激素应答的模式上并不呈简单线性相关,可能存在多层次、多方位的调控。     

龙眼TIR1和ABP1基因的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

AIM: To investigate the expression and the role of histone deacetylase 8 (HDAC8) in cardiac hypertrophy and the effects of valproic acid sodium (VPA, a histone deacetylase inhibitor) on the expression of HDAC8 and cardiac hypertrophy in two-kidney two-clip (2K2C) renovascular hypertensive rats. METHODS: Male SD rats were randomly divided into sham operation group, 2K2C group, high dose VPA (400 mg穔g^-1穌^-1) treatment group, low dose VPA (200 mg穔g^-1穌^-1) treatment group and candesartan (10 mg穔g^-1穌^-1) treatment group.Four weeks after surgery,the rats were intraperitoneally injected with VPA for 4 weeks. Sham operation and 2K2C rats were given vehicle for 4 weeks. All animals were sacrificed 8 weeks after surgery. The ratio of left ventricular weight to body weight (LVW/BW) was calculated and pathological changes of the myocardium were observed with HE staining. The mRNA expression of atrial natriuretic factor (ANF) and HDAC8 was examined by RT-PCR. The protein level of HDAC8 was also measured by Western blotting analysis. RESULTS: Compared with the control rats, the mRNA and protein expression of HDAC8 significantly increased in the myocardium in 2K2C rats while the mRNA and protein expression of HDAC8 was significantly decreased by VPA treatment in 2K2C rats. The mass index (as measured by LVW/BW) and cardiomyocyte cross areas were markedly increased and myocardial fibers were disordered in 2K2C rats, but these parameters were markedly reversed after treated with VPA for 4 weeks, indicating that VPA attenuated cardiac hypertrophy. Moreover, VPA also decreased the mRNA expression of ANF. CONCLUSION: HDAC8 may play an important role in cardiac hypertrophy in 2K2C renovascular hypertensive rats. VPA inhibits the expression of HDAC8 and prevents the development of cardiac hypertrophy.     

龙眼胚性愈伤组织Remorin家族成员的克隆及其在体胚发生过程中的表达分析

以龙眼松散形胚性愈伤组织为材料,采用RT-PCR结合RACE法克隆Remorin家族5个成员的cDNA全长,DlRemorin1全长2 127 bp,编码572个氨基酸;DlRemorin2全长1 829 bp,编码444个氨基酸;DlRemorin3全长1 937 bp,编码541个氨基酸;DlRemorin4全长1 743 bp,编码466个氨基酸;DlRemorin5全长1 043 bp,编码181个氨基酸。DlRemorin1 ~ 5 DNA序列长度分别为：4 054、3 097、3 505、4 690和1 935 bp,所有内含子剪切位点均符合真核生物“GT-AG”规则。所有成员均是不稳定亲水性蛋白,都不具有信号肽,只有DlRemorin1具有跨膜结构,都具有Remorin家族保守结构域,与其它植物的Remorin具有较高的同源性。系统进化树分析结果表明,DlRemorin5为经典的Remorin蛋白,DlRemorin1与DlRemorin2属于长链Remorin。qRT-PCR结果显示,随着龙眼体胚的发育,DlRemorin1的表达量呈类“N”状趋势,在心形胚时期和子叶形胚时期较高;DlRemorin2在心形胚和子叶形胚时期迅速下降;DlRemorin3在发育中后期迅速升高,并在子叶形胚时期最高;DlRemorin4在球形胚和鱼雷形胚时期最低,而DlRemorin5在不完全胚性紧实结构时期最低。说明DlRemorin1 ~ 5在龙眼体胚发生过程的转录水平具有一定的组织特异性和时序性。psRNA Target预测显示DlRemorin还可能受到miRNA家族的调控。     

龙眼miR397家族成员分子特性及其在体胚发生早期的表达分析

【目的】探讨龙眼miR397家族成员的分子特性及其在龙眼体胚发生早期的表达模式。【方法】以‘红核子’龙眼胚性愈伤组织为材料,通过对龙眼miR397前体序列二级结构分析、进化树构建、靶基因预测与裂解位点验证、以及龙眼miR397a在龙眼体胚发育早期和不同激素浓度处理下的表达规律进行分析。【结果】龙眼miR397前体序列5端臂上可生成两个序列高度重合的成熟体序列dlo-miR397a和dlo-miR397,二者仅有5端两个碱基TC之间的差异,前体能形成稳定的茎环结构;进化树分析发现龙眼miR397前体与桃、可可、脐橙等亲缘关系较近,处于同一分支,龙眼miR397与拟南芥、甜橙、葡萄等亲缘关系较近,处于较为保守的同一分支,miR397家族成员较前体序列在进化上更为保守。靶基因预测表明龙眼miR397家族主要靶向调控漆酶基因家族和一条姐妹染色单体粘连蛋白(dlo_039206.1)。裂解位点验证发现靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的裂解位点,但位于预测区间外。miR397a在体胚发生过程中对于靶基因姐妹染色单体粘连蛋白的调控模式在0～3 d较为一致,均为下调表达,6～12 d为显著上调表达,且二者呈典型的负调控关系。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,而靶基因姐妹染色单体粘连蛋白则在激素处理下的表达趋势并不明显,可能由于靶向裂解位点在预测区外所致。【结论】龙眼miR397a可能在龙眼体胚发生早期的6～12 d,通过靶向调控姐妹染色单体粘连蛋白影响龙眼体胚发生早期形态建成。龙眼miR397家族在进化上较为保守,其靶基因主要靶向调控龙眼漆酶家族和姐妹染色单体粘连蛋白。龙眼miR397a在不同浓度2,4-D与GA3激素处理下均出现下调表达趋势,表明其在龙眼体胚发生早期可能通过激素信号传导参与龙眼体胚发生早期形态建成。     

龙眼体胚成熟过程中的组织细胞学观察

以“红孩子Ⅰ”、“红核子Ⅱ”、“十二月龙眼”胚性愈伤组织诱导出的小子叶形体胚为试材，研究了乇照条件、蔗糖浓度、聚乙二醇、脱落酸及椰乳等因素对龙眼体胚或熟过程中的组织细胞学的影响。结果表明：在黑暗高糖(5％)、黑暗高糖加椰乳的条件下，体胚成熟过程中明显可见胚根、胚芽原基的形成，即经历正常成熟过程；在光照低糖、光照高糖、黑暗低糖、黑暗低糖加PEG、黑暗低糖加ABA、黑暗高桔加ABA等条件下，体胚成熟过程中虽然早期可见胚根、胚芽原基的形成，但成熟后期胚根、胚芽原基消失，即经历非正常成熟过程。     

龙眼亚硫酸盐氧化酶(DlSO)基因的克隆及表达分析

【目的】探讨龙眼果实亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO)在硫残留生物降解中的作用。【方法】以龙眼总RNA为模板,采用RT-PCR结合RACE法获得龙眼亚硫酸盐氧化酶基因全长cDNA序列,命名为DlSO;运用荧光定量PCR对其表达量进行分析;使用ClontechIn-Fusion技术构建原核表达载体,使其在Rosetta(DE3)大肠杆菌中表达。【结果】DlSO序列全长1413bp,包含一个1182bp的开放阅读框,一个长37bp的5’非翻译区序列和194bp的3’非翻译区,预测编码393个氨基酸;同源性和系统进化分析结果均表明DlSO与毛果杨SO亲缘关系最近;荧光定量结果表明,在龙眼不同组织中,DlSO基因都有表达,其中在叶片中表达量最高,其次是花、幼果、根和果肉,在茎和果皮组织中DlSO基因的表达量最低;成功构建pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导后在Rosetta(DE3)大肠杆菌中成功表达。【结论】克隆了龙眼亚硫酸盐氧化酶基因(DlSO),并且成功构建了pET-32a-DlSO原核表达载体,经IPTG诱导在大肠杆菌中成功表达出融合蛋白,为下一步研究龙眼亚硫酸盐氧化酶的作用奠定了基础。     

龙眼miR408与DlLAC12克隆及其在球形胚发生和非生物胁迫下的表达分析

为探讨mi R408及靶基因DlLAC12在龙眼球形体细胞胚诱导及不同非生物胁迫下的表达模式,采用miR-RACE PCR和Tail-PCR克隆获得pri-miR408 cDNA和转录起始位点、dlo-miR408 gDNA、靶基因DlLAC12 cDNA及启动子pro-MIR408序列。研究结果显示：dlo-pri-miR408 cDNA、gDNA全长均为706 bp,5′端转录起始位点为胞嘧啶（C）。DlLAC12 cDNA全长为1 725 bp,pro-MIR408全长为1 532bp。pro-MIR408序列上存在ABA、GA3、JA等激素信号传导顺式作用元件和响应光、低温胁迫等相关元件。q RT-PCR结果显示,dlo-miR408-3p随外源添加的蔗糖浓度、Cu2+浓度及培养温度的变化呈现动态表达;而dlo-miR408-5p1对蔗糖不敏感,在铜离子失衡和低温时下调表达。dlo-miR408-3p与DlLAC12负调控模式能响应高浓度ABA（≥500μmol·L-1）处理,而不同浓度GA3处理下二者表达模式一致。dlo-miR408-3p与DlLAC12在球形胚诱导不同天数...     

龙眼miR172家族成员进化特性及其时空表达分析

【目的】研究龙眼miR172家族的进化特性及其在龙眼不同组织部位中的表达模式。【方法】采用生物信息学分析及实时荧光定量PCR的方法,对龙眼miR172家族5条前体(pre-miR172)序列及1条成熟体序列进行分析,并预测其前体二级结构,构建系统发育进化树,预测靶基因及分析不同组织部位的定量表达情况。【结果】对龙眼miR172家族5条前体序列进行多序列比对,发现miR172家族两端相对保守,中间区域则形成各自的特异性区域。对miR172家族5条前体及1条成熟体进行多序列比对,发现6条序列间存在1个约20个碱基的保守区域,推测该区域可能为miR172家族成熟体所在区域。Mfold软件预测结果显示,pre-miR172家族成员均能形成典型的茎环二级结构,其最小折叠自由能为-35.80~-54.45 kal·mol-1,较为稳定。系统发育进化树结果显示,龙眼pre-miR172家族成员与甜橙、毛果杨等植物的miR172亲缘关系较近。靶基因预测结果显示,龙眼miR172a的靶基因包括AP2、蝶呤型钼辅因子(molybdopterin cofactor)、谷氨酰-t RNA(glutamyl-t RNA)、假定蛋白(hypothetical protein)等。实时荧光定量PCR结果显示,miR172家族各成员在龙眼不同组织部位中的表达模式总体相似,均在叶芽和生殖生长阶段中大量表达,在营养生长阶段及果实中表达量则较低,但dlo-miR172-scaffold4293特异地在叶片中高表达。【结论】龙眼miR172家族在进化过程中保守性与特异性并存,且可能参与了龙眼部分器官的形成及发育过程。     

龙眼染色质重塑因子Snf2基因家族的进化动力学研究及在体胚发生早期的表达

以龙眼(Dimocarpus longan Lour.)'红核子'品种早期体细胞胚胎发生的胚性愈伤组织(embryogenic callus,EC)、不完全胚性紧实结构(incomplete embryogenic compact structures,ICpEC)和球形胚(globular embryos,GE)为材...     

龙眼胚胎F3H基因的cDNA克隆及序列分析

采用IEF-SDS-PAGE双向电泳技术,对‘立冬本'龙眼合子胚发育不同时期的蛋白质进行分离,通过MALDI-TOF-TOF鉴定到其中一个上调差异表达的蛋白为黄烷酮-3-羟化酶 (flavanone 3-hydroxylase,F3H)。以‘立冬本’龙眼胚胎cDNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术,获得F3H基因cDNA 1 404 bp全长序列。序列分析表明,F3H基因共编码365个氨基酸,其cDNA序列与柑橘、苹果、棉花等F3H基因的同源性均高达80%以上,该基因在GenBank中登录号为EF468104。     

菠萝体细胞胚发育过程的形态学和解剖学研究

 以‘神湾’菠萝（Ananas comosus‘Shenwan’）愈伤组织为材料,对体细胞胚发育过程中的形态和组织结构变化进行了观察和石蜡切片研究。结果表明,菠萝体细胞发育过程可划分为原胚、球形胚、梨形胚、笋形胚和成熟胚等5个时期。原胚是由胚性细胞分化和分裂形成的多细胞结构,呈棒状至纺锤形,最粗处直径50 ~ 200 μm,灰白色,细胞较均匀一致,未出现组织分化。球形胚近球形,直径200 ~ 500 μm,已开始组织分化,在后期能清楚观察到一些原维管束组织存在。梨形胚呈上细下粗的梨形,长600 ~ 1 000 μm,最粗处在胚体中下部（直径400 ~ 800 μm）,已经具备轴向性和双极性,子叶原基组织呈帽状将胚芽原始体包在其中。笋形胚似冬笋状,长1 000 ~ 2 000 μm,下部最粗处直径600 ~ 1 000 μm,后期子叶原基、胚芽鞘原基和胚芽原基已清晰可见。成熟胚长2 000 ~ 4 000 μm,下部最粗处直径1 000 ~ 1 500 μm,胚芽端已具子叶、胚芽鞘、叶原基和胚芽生长点,而胚根原基分化较慢,外围有一层胚根鞘组织。胚芽和胚根内源生,子叶衣领状,第一枚叶（胚芽鞘）基部鞘状,胚轴短,叶原基呈莲座状着生在上胚轴顶端,是菠萝体细胞胚的重要特征。     

金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆及表达分析

PCR扩增了金针菇(Flammulina velutipes)异戊烯基焦磷酸异构酶基因(FvIDI)的DNA全长和开放阅读框序列.该基因的ORF全长753 bp,DNA全长923 bp,含有3个内含子和4个外显子,编码250个氨基酸,金针菇异戊烯基焦磷酸异构酶相对分子质量为28450,等电点为5.05.采用实时荧光定量PCR技术研究FvIDI基因在不同发育时期和不同温度下的表达量,结果显示,FvIDI基因在采收期菌盖中表达量最高,4℃诱导处理2～4 h和37℃诱导处理2～6 h的表达量明显高于常规温度21℃处理.     

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA（GenBank登录号：JF412788）,该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸（ABA 50 μmol · L^-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L^-1）5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG 和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。     

番木瓜半胱氨酸蛋白酶基因CpCP的分离及表达分析

采用cDNA-AFLP技术分离了一个与番木瓜果实成熟衰老相关的差异片段,经生物信息学分析证实该片段属于半胱氨酸蛋白酶（Cysteine Protease,CP）基因。将差异片段序列在NCBI中的番木瓜基因组序列中搜索,获得了半胱氨酸蛋白酶基因DNA序列。设计开放型阅读框上、下游引物,以木瓜果肉RNA逆转录的cDNA为模板扩增该基因全长cDNA序列,命名为CpCP（登录号：JN689334）。该基因属于C1肽酶家族中的C1A亚家族,编码471个氨基酸,含有家族特有的催化三联体：Cys166-His302-Asn322。Real-time PCR结果显示CpCP在果实中大量表达,是根、茎、叶、花中表达量的几十倍;CpCP受乙烯处理诱导,受1-MCP处理抑制,表达模式与番木瓜果实成熟衰老进程一致,说明CpCP参与了番木瓜果实成熟衰老进程。     

茉莉花萜类合成酶基因JsTPS的克隆及其表达分析

以双瓣茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术相结合的方法,克隆了萜类合成酶基因（JsTPS）的全长cDNA,该cDNA全长为1 884 bp,其中ORF为1 491 bp,编码496个氨基酸的蛋白,分子量56 989.7 D,与原核表达结果一致。序列分析结果表明,该基因编码的氨基酸序列与油橄榄（Olea europaea）的TPS2具有75%的同源性,同属于α-Farnesene synthase分支。采用荧光定量PCR技术检测JsTPS在茉莉花开放过程中的表达量变化,结果表明,表达量在未开放时（18：00）最低,在半开放时（22：00）达到最高。