结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体构建及转化

以pBI121植物表达载体和BoVIN3-1基因片段为基础,构建结球甘蓝春化相关基因VIN3反义植物表达载体。将BoVIN3-1基因片段反向插入355启动子与GUS基因之间的限制性酶切位点XbaⅠ和SmaⅠ中,构建含反义BoVIN3-1基因的工程质粒pBI35S-BoVIN3-1。通过花蕾微量注射法转化结球甘蓝,获得9株转化植株。PCR检测结果表明,其中5株为阳性植株,阳性株率55.6%。经春化处理的转反义基因植株与对照相比,春化一定程度被推迟。半定量RT-PCR检测结果表明,转化植株在进行低温处理后仍有该基因少量表达,并随春化处理时间的延长转录水平升高,在第50天时表达量达到最高。     

菊花开花抑制基因CmFLC-like1的克隆及表达特性分析

为深入研究夏菊的春化机理,利用多聚酶链式反应（PCR）结合5′ RACE、3′ RACE技术克隆夏菊品种‘优香’[Chrysanthemum morflorium（Ramat.）Kitam.‘Yuuka’]开花抑制基因CmFLC-like1的cDNA全长序列,获得其全长为945 bp,开放阅读框（ORF）为636 bp,编码1条211个氨基酸残基的多肽,且具有典型的MADS结构域。同源性分析表明,CmFLC-like1与葡萄（Vitis vinifera）VvFLC和龙眼（Dimocarpus longan）DlFLC的同源性最高,分别为55%和52%。进化树聚类分析表明,CmFLC-like1蛋白与拟南芥和核桃的FLC遗传距离最近。亚细胞定位表明,CmFLC-like1基因定位在核上。在酵母体系中发现CmFLC-like1没有转录激活活性,拟南芥原生质体转化发现具有转录抑制活性。菊花植株营养生长期不同组织器官的RT-PCR表明CmFLC-like1在叶片中表达量最高,茎和茎尖中次之,根中最少。低温（4 ℃）可抑制CmFLC-like1表达,且处理时间越长,抑制表达越明显。     

白菜离体春化相关基因表达的cDNA-AFLP分析

 借助cDNA-AFLP技术分离到15个与白菜离体春化反应相关的表达序列标签( EST) 。Blast结果表明: 低温春化处理抑制性表达的12个EST, 多与异化作用相关基因同源性较高; 春化诱导表达的3个EST, 分别与编码核糖体蛋白的亚基(或与自主开花途径相关的FAC基因连锁的因子) , ATPase的亚基,小G - 蛋白亚基的基因同源性较高。     

金钗石斛SEP3-like基因的克隆及其在春化过程中的表达分析

 通过同源克隆从低温春化处理的金钗石斛腋芽中分离到1个SEP3-like基因的全长cDNA。该cDNA含有长度为684 bp的开放阅读框,可编码由227个氨基酸组成的蛋白质。同源搜索和系统进化分析表明,该蛋白与拟南芥AtSEP3同源,并同属于MADS-BOX 家族的SEP亚家族中的SEP3分支,故将该基因暂定名为DnSEP3-like。与其它的石斛属的SEP3蛋白类似,DnSEP3-like蛋白缺失C–末端的部分基序。DnSEP3-like基因的表达受春化作用的影响,其转录产物随春化时间延长逐渐积累,在春化20 d时达到峰值,暗示该基因可能参与春化调控开花的生物学过程。     

辣椒乙烯反应转录因子基因CaJERF1 的克隆及诱导表达

 应用RT-PCR、RACE技术从乙烯诱导的辣椒中克隆到一个乙烯反应（ERF）类转录因子基因,命名为CaJERF1,其全长cDNA序列为1 379 bp,编码375个氨基酸,分子量为41.5 kD,具有一个由59个氨基酸构成的保守的ERF结构域。CaJERF1的AP2域与CaPF的同源性为100%,与JERF1的同源性为99%;全序列与CaPF和JERF1的同源性也分别达到99%和86%,属于ERF家族的第Ⅳ次家族。诱导分析表达结果表明,植物激素乙烯、苿莉酸甲酯以及盐和低温胁迫均可诱导该基因的表达,表明CaJERF1可能参与到多条信号途径中,并在多种逆境胁迫应答中发挥作用。     

欧洲山芥皂苷合成关键酶基因Bv-beta-AS 克隆及表达分析

 以能够产生抗虫皂苷的高抗小菜蛾资源G 型欧洲山芥（Barbarea vulgaris R. Br.）B44 为材料,利用RACE 技术克隆出皂苷合成关键酶beta–香树脂合成酶的基因（Barbarea vulgaris beta-amyrin synthase,Bv-beta-AS）。该基因编码区序列长为2 289 bp（GenBank 登录号JQ172795）,推导其编码762个氨基酸;在基因组水平上长度为4 107 bp （GenBank 登录号JQ172796）,含有15 个内含子。Bv-beta-AS编码的氨基酸具有beta–香树脂合成酶基因家族的保守序列,即DCTAE 序列和QW 特征序列,氨基酸多序列比对和进化树分析表明,该基因与拟南芥beta–香树脂合成酶基因的相似性最高,为74%。利用荧光定量PCR 对欧洲山芥在小菜蛾诱导下该基因的表达进行研究,结果表明,该基因受虫害诱导时上调表达,但是上升到12 h 达顶峰后随时间推移呈回归的趋势。从序列特征和表达模式上推测,Bv-beta-AS 可能是抗虫皂苷合成途径的一个关键酶的基因。     

胡萝卜FLC 同源基因对低温及光周期响应

 基于‘松滋野生’（Ws）和‘Amsterdam’（Af）胡萝卜转录组测序，挖掘胡萝卜FLC 同源 基因（DcFLCs），深入研究其对低温及光周期响应规律。结果表明，胡萝卜中存在3 个具有完整MADS-box 和K-box 保守结构域的FLC 同源基因DcFLC1、DcFLC2、DcFLC3，分别编码209、212、219 个氨基酸 残基蛋白，进化树显示与其它植物FLC 亲缘关系较远。RT-PCR 表明DcFLC1 和DcFLC2 在供试材料中均 表达，而DcFLC3 仅在部分材料中表达。qPCR 结果显示低温能促进DcFLC1 和DcFLC3 在耐抽薹品种 Af 幼苗叶片和种根中表达，而DcFLC2 仅在Af 种根中表达显著，在幼苗叶片中表达不显著。DcFLC1 和 DcFLC2 在抽薹敏感的Ws 幼苗叶片和种根春化过程中表达规律不同，低温能促进DcFLC1 在幼苗叶片以 及DcFLC2 在种根中表达。连续光照能促进DcFLC1、DcFLC2 在Af 幼苗叶片中表达，但在Ws 中则不同。     

马蔺cbf转录因子的克隆及序列分析

根据GenBank已发表的拟南芥cbfs转录因子基因序列设计特异性引物, 采用PCR和RT-PCR方法, 从鸢尾科野生花卉马蔺基因组DNA和cDNA中克隆出cbf转录因子基因片段, 将其克隆到pMD18-T-Vector上。经序列测定及分析表明, 两种途径得到的cbf基因序列相同, 基因全长642 bp, 可编码213个氨基酸。同源性分析表明该基因的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它植物cbf类基因具有同源性, 尤其与拟南芥cbf1和黄瓜cbf1基因有很高的同源性, 氨基酸同源性高达97%。鉴于同cbf1基因高的同源性, 初步确定克隆到马蔺cbf1转录因子基因, 命名为Ilcbf1, 在GenBank中登录号为DQ131497。     

草莓FaCBF1基因的克隆及表达分析

以‘丰香’草莓为试材,通过SON-PCR结合RT-PCR技术获得了1个冷诱导转录因子CBF/DREB家族基因编码区全长cDNA序列,命名为FaCBF1,GenBank登录号为FJ767754。该基因包含1个长为636 bp的完整开放阅读框,编码211个氨基酸,预测分子量为23.4 kD,等电点为6.53。氨基酸同源性分析表明,FaCBF1与GenBank中登录的蔷薇科植物CBF/DREB具有较高的同源性。进化树分析表明,草莓FaCBF1与近缘属的月季、苹果和沙梨处于同一进化枝上,而与李属植物进化关系较远。半定量RT-PCR分析显示,FaCBF1能被低温、干旱和高盐胁迫诱导,但对ABA诱导不敏感;在同一诱导时期在根中的表达量高于叶和茎中的表达量。     

春化对白菜DNA 甲基化、GA含量及蛋白质的影响

 以普通白菜‘油冬儿’为试材, 研究了低温对白菜开花的诱导效应, 并分析了萌动种子和幼苗春化诱导后DNA 甲基化水平、赤霉素(GA) 含量和蛋白质种类的变化。结果表明, 不论萌动种子还是幼苗, 4 ℃低温处理30 d 均可完成春化。春化处理后, 两处理植株茎尖组织DNA 甲基化水平都较对照下降;但GA 含量明显上升, 为对照的2～3 倍; 低温诱导植株产生了一种分子量为58 kD 的特异蛋白质, 同时也使一种蛋白质消失。说明低温可能通过降低DNA 甲基化水平或增加GA 含量而诱导植物开花。     

种芽春化和绿体春化对大白菜现蕾及开花时间的影响

以100个大白菜品种的高代自交系为试验材料,研究了种芽春化和绿体春化两种春化方式对大白菜现蕾时间、开花时间的影响。结果表明:种芽春化处理的100个大白菜品种的平均现蕾时间、开花时间比绿体春化处理分别提前了15.0d和11.5d。其中春泉大种芽春化不能使其现蕾和开花,而绿体春化则可以使其现蕾,这可能是因为参与两种春化方式调控的分子机制不同。不同冬性的大白菜品种在两种春化处理方式下,其现蕾时间、开花时间的变化趋势一致,说明两种春化方式对大白菜不同品种的影响具有通用性和一致性。     

大白菜脱春化效果及脱春化前后DNA 甲基化分析

针对春大白菜极易经历低温春化而先期抽薹的现象,以大白菜一代杂种阳春为试材,在光照培养箱条件下进行绿体脱春化、种子脱春化及在温室条件下进行绿体脱春化研究。结果表明：高温可以使大白菜脱春化;随着高温处理时间的延长,脱春化效果逐渐增强;种子脱春化效果比绿体脱春化效果好。基因组DNA 甲基化水平检测结果表明：春化时大白菜植株发生去甲基化,脱春化处理可诱导其重新甲基化。     

茶树脂肪酸去饱和酶家族基因的克隆与表达分析

以茶树品种‘铁观音’为试材,利用RT-PCR技术克隆得到5个脂肪酸去饱和酶（fatty acid desaturase,FAD）家族基因的cDNA序列,分别命名为CsFAD2-2、CsFAD3、Δ7-CsFAD、Δ8-CsFAD和CsFAB2,其编码序列长度1 137 ~ 1 320 bp。系统发育与基序分析结果表明,茶树FAD成员来自4个亚家族,即ω3/ω6-FAD亚家族、Δ7/Δ9-FAD亚家族、Front end FAD亚家族和FAB亚家族。同一亚家族成员的保守基序一致,而不同亚家族的保守基序存在较大不同。荧光定量PCR结果表明,5个CsFAD家族基因都显著响应低温诱导,Δ8-CsFAD对低温胁迫响应最强烈,表达水平上调千倍;外源ABA处理后,除CsFAD3外,其他4个CsFAD基因的表达均上调2倍以上;干旱胁迫下,5个CsFAD中CsFAD2-2、Δ7-CsFAD和Δ8-CsFAD表达水平都上调1.5倍以上,其中Δ8-CsFAD的表达上调最大,达5.5倍,而CsFAD3和CsFAB2的表达受到干旱处理抑制显著下调。克隆并分析Δ8-CsFAD启动子,发现存在多种与逆境胁迫响应相关的顺式元件。烟草亚细胞定位观察表明Δ8-CsFAD定位于细胞膜。根据上述结果推测5个CsFAD可能参与茶树抗逆响应,尤其是Δ8-CsFAD,可能通过调控茶树细胞膜不饱和脂肪酸的合成进而影响茶树的抗逆性。     

芥蓝八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2的克隆与表达分析

以白花芥蓝为材料,采用反转录PCR技术克隆得到2个八氢番茄红素脱氢酶基因BaPDS1和BaPDS2,GenBank登录号为KX426039和KX426040,其开放阅读框分别为1 692和1 698 bp,分别编码563和565个氨基酸。同源性及进化树构建结果表明PDS蛋白在进化过程中比较保守,芥蓝PDS基因与甘蓝、白菜、花椰菜等十字花科蔬菜亲缘关系较近。半定量PCR分析发现,BaPDS1和BaPDS2表达水平在芥蓝不同发育时期和组织器官间均存在显著差异。萌动种子期BaPDSs表达量较低,之后迅速上升;BaPDS1在成熟期器官间呈现组成型表达,BaPDS2在器官间表达差异较大,幼果中未检出;花器官中萼片的BaPDSs表达量显著低于其他组织,在开花过程中,雄蕊和雌蕊的BaPDS1表达水平出现上调。     

橘红色形态标记在抗根肿病橘红心大白菜雄性不育系转育中的应用

橘红心大白菜球心色由1对隐性等位基因控制,其子叶颜色、花色的遗传与球心色的遗传表现一致,可以作为橘红心大白菜的形态标记性状在转育中使用。本试验在转育抗根肿病橘红心大白菜核基因雄性不育系的过程中比较了球心色法、子叶法和花色法在不同条件下筛选抗根肿病橘红心雄性不育系的特点。结果表明：无论是种子春化处理还是非种子春化处理,子叶法在子叶展开时就可以筛选到橘红心性状,得到抗根肿病橘红心植株需要抗性筛选的株数最少,耗用根肿菌菌土量最少。可以说,子叶法转育抗根肿病橘红心雄性不育系适用范围广、工作强度小,是3种方法中最理想的方法,利用此方法可以简化抗根肿病橘红心大白菜雄性不育系的转育进程。     

大白菜温度敏感雄性不育育性转化相关XET基因的电子克隆

以从大白菜温敏雄性育性转化相关基因差异表达的分析中获得的EST-58为标签,采用电子克隆的方法对其进行延伸,并对电子克隆的结果进行RT-PCR验证,结果表明:电子克隆到1个由1197bp核苷酸组成的序列,该序列具有完整的开放阅读框架(ORF),编码蛋白为292个氨基酸。经RT-PCR扩增,连续样品间EST-58表达的带型变化趋势与cDNA-AFLP的差异显示情况一致,且RT-PCR获得的序列与电子克隆的序列一致性达98%。用该序列在GenBank数据库中进行blastX同源性分析,确定该序列为大白菜的XET基因(GenBank登陆号为EU579461)。     

结球甘蓝高温春化逆转过程中几种内源激素含量的变化

以结球甘蓝早熟品种8398和中熟品种京丰1号为试材,分别在植株长至7片和9片真叶时进行绿体春化处理18和21d,再进行37℃高温春化逆转12h,研究结球甘蓝高温春化逆转过程中内源激素含量的变化。结果表明:在高温春化逆转过程中,结球甘蓝植株体内GA3含量变化不大,IAA含量呈上升趋势,ABA含量呈下降趋势。与低温春化的对照相比,在高温春化逆转结束时,GA3和ABA含量显著降低,而IAA含量显著升高。低水平的GA3和ABA含量和高水平的IAA含量有利于春化逆转完成。     

促生菌NK1诱导白菜幼苗对炭疽病抗性的研究

 以植物根围促生细菌NK1菌株为诱导因子,对其诱导白菜抗炭疽病进行了研究。结果表明：用菌株NK1灌根处理白菜幼苗后,叶片上病斑数及病斑面积较对照明显减少（P<0.05）,对炭疽病防效达68%。不同诱导方法诱抗效果呈显著性差异（P<0.05）,其中以种子处理+灌根处理方法的诱导效果最好。对菌株NK1诱导持效期的研究发现,诱抗效果以菌株NK1处理白菜植株后的第5 d接种白菜炭疽病菌时最好。此外,用菌株NK1灌根法处理白菜根部后,白菜根部与叶片组织中的几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性较对照都明显升高（P<0.05）,表明菌株NK1能诱发白菜对炭疽病产生系统抗性。