绿色木霉几丁质酶基因Tvchi cDNA的克隆、原核表达与活性分析

 利用RT PCR方法从绿木霉ZBS 6中扩增了几丁质酶基因Tvchi,序列分析表明Tvchi 开放阅读框为1 293 bp,编码430个氨基酸残基,Blast 分析表明,与多种木霉18家族内切几丁质酶具有较高的同源性。将该基因克隆到原核表达载体pET 28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS PAGE和Western印迹分析表明成功的获得了47 kD 的融合蛋白。该融合蛋白经Ni NTA柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白Tvchi。Tvchi最适酶活温度为37℃,最适酶活pH值为6.8。表达产物对小麦全蚀病、赤霉病、纹枯病病原菌显示出较好的抑菌活性。本研究结果将为进一步研究木霉几丁质酶的应用提供了基础。     

dsRNA分解酶PAC 1对4种植物病毒、3种类病毒dsRNA的降解活性检测及转pac 1基因烟草的获得

 将来自粟酒裂殖酵母的pac 1基因,导入原核表达载体pET-5a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,其表达产物能够降解4种植物病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、Tobacco mosaic virus(TMV)、Rice black-streaked dwarf(RBSDV)和Rice dwarf virus(RDV)和3种类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)、Coleus blumei viroid(CBVd)和Hopstunt viroid(HSVd)的dsRNA。将pac 1导入双元载体pBI121,并转入根癌农杆菌LBA4404,以烟草(品种NC89)组培苗的叶片为受体材料进行转化,经过诱导愈伤、分化、再生和筛选培养,获得了50株Kan抗性植株,收获T₁种子分别播种,对这些转基因植株进行分子生物学检测。PCR、PCR-Southern和RT-PCR检测结果表明,pac 1基因已整合到受体基因组中。     

二点螟几丁质酶1基因CiChi1的克隆和功能分析

为明确几丁质酶1(chitinase 1,Chi1)编码基因在二点螟Chilo infuscatellus中的潜在功能,对Chi1基因进行全长序列克隆和生物信息学分析,使用实时荧光定量PCR技术检测该基因的时空表达模式,利用RNA干扰技术探究其在二点螟生长发育方面的功能。结果表明,二化螟Chi1基因序列全长为1 788 bp,开放阅读框为1 653 bp,编码550个氨基酸,并命名为CiChi1;CiChi1基因在二点螟不同发育阶段及不同组织中均有表达,其中在成虫期的相对表达量最高,在6龄幼虫期的相对表达量次之,且在6龄幼虫表皮中的相对表达量最高;在RNA干扰试验中,注射ds CiChi1的二点螟3龄幼虫试验组在第14天的最终死亡率为62.0%,显著高于注射ds EGFP的阴性对照组（27.8%）和注射蒸馏水的空白对照组（33.9%）;此时试验组的平均虫重为0.024 g,显著低于阴性对照组（0.039 g）和空白对照组（0.040 g）,且试验组试虫还伴随有外表皮急剧变黑、消解软化的致死表型;实时荧光定量PCR检测结果表明,试验组试虫体内CiChi1基因表达量较阴性对照组和空白对照组...     

球孢白僵菌SJ-05几丁质酶基因的克隆与序列分析

几丁质酶在昆虫真菌侵染寄主过程中起着重要的作用。本文对采自内蒙古准格尔旗沙棘木蠹蛾的球孢白僵菌菌株SJ-05进行了几丁质酶的基因分析,从中克隆了几丁质酶Bbchit基因,得到了重组质粒pMD19-T/chit。测序结果表明,Bbchit基因核苷酸序列阅读框架全长为1047 bp,编码348个氨基酸,推测分子量为36.924 ku,等电点为5.94。氨基酸序列比对结果表明,与球孢白僵菌Bb0062菌株（AAN41259.1）的氨基酸序列相似性最高,为99.71%。     

滞育七星瓢虫酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因的克隆及表达分析

去饱和酶（Fatty acid desaturase,FAD）是生物体不饱和脂肪酸合成中的关键酶,酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因是其中重要的一种。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据,利用RT-PCR和RACE技术从滞育七星瓢虫中克隆得到酰基辅酶AΔ11去饱和酶基因全长,并命名为CsFadΔ11（GenBank登录号：MF458996）,该基因全长1447 bp,开放阅读框（ORF）1095 bp,编码364个氨基酸,预测蛋白质分子量为42.99 kD,等电点（pI）为8.87,无信号肽。氨基酸序列分析结果表明,CsFadΔ11有3个组氨酸富集区和6个跨膜结构域,与膜翅目的内华达古白蚁Zootermopsis nevadensis同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术研究其时间表达模式,发现CsFadΔ11基因在七星瓢虫初羽化、滞育诱导10 d、滞育诱导20 d、滞育初期、滞育后期、滞育解除期以及正常发育状态下均有所表达,且在滞育早期表达量最高,其次是在滞育解除个体中。其整体表达趋势与相应时期脂积累变化情况基本相符,推测CsFadΔ11基因参与七星瓢虫脂积累调控,并进一步影响七星瓢虫滞育。     

象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶基因的克隆及其RNAi 效应分析

 从象耳豆根结线虫中首次克隆了果胶酸裂解酶基因Me-pel-1,该基因cDNA 的开放阅读框(ORF)长813 bp,编码270 个氨基酸,具有果胶酸裂解酶第3 家族的4 个保守域特征。ME-PEL-1 与南方根结线虫的果胶酸裂解酶MI-PEL-1 和爪哇根结线虫的果胶酸裂解酶MJ-PEL-1 相似性最高,且系统进化树显示ME-PEL-1 也与它们最为接近。利用RNAi 技术对象耳豆根结线虫2 龄幼虫的Me-pel-1 进行沉默,结果发现Me-pel-1 基因被干扰后,象耳豆根结线虫2 龄幼虫对番茄的侵染率显著降低。该结果表明Me-pel-1 基因在象耳豆根结线虫侵染寄主的过程中发挥重要作用。     

沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,采用实时荧光定量技术(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明,沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1 699 bp,开放阅读框长为1 479 bp,编码492个氨基酸;沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高,为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间相对表达量维持在低水平,而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0～40℃范围内,随着温度增加,己糖激酶基因在沙葱萤...     

褐飞虱clip丝氨酸蛋白酶基因NlCSP4的克隆及功能分析

Clip丝氨酸蛋白酶（clip-domainserineprotease,CSP）是广泛存在于昆虫体内的一类结构保守、功能多样的蛋白质水解酶类,在昆虫生长、发育和免疫等诸多生理过程中发挥重要功能。本研究克隆并鉴定获得一个褐飞虱CSP编码基因NlCSP4(GenBank登录号：OK018340）,其cDNA序列全长1911bp,编码636个氨基酸,预测蛋白质分子量为69.29kD,等电点为9.02。NlCSP4蛋白N端包含一段由25个氨基酸残基组成的信号肽和一段由44个氨基酸残基组成的clip结构域,C端具有CSP蛋白家族典型的Tryp＿SPc结构域,且其中包含特异性保守的His-Asp-Ser催化中心三元件。系统发育分析表明NlCSP4与其他同属半翅目昆虫的CSP在NJ进化树上聚为一支,而与鳞翅目昆虫CSP亲缘关系较远。qRT-PCR分析显示,NlCSP4基因表达具有明显的时空特异性,其在雌成虫中的表达量最高,且高龄若虫期（4龄和5龄）表达量显著高于卵期和1～3龄若虫期;NlCSP4基因在褐飞虱雌成虫脂肪体、肠道和卵巢中均有表达,且在脂肪体中表达量最高;金黄色葡萄球菌（革兰氏阳性细菌）...     

豌豆蚜防控的关键RNAi靶标基因筛选与分析

为筛选防控豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的关键RNA干扰(RNA interference,RNAi)靶标基因,通过构建精氨酸激酶(arginine kinase,AK)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和几丁质合成酶(chitin synthase,CHS)这3个与豌豆蚜生长发育相关基因的dsRNA,于室内检测ds AK、ds SOD和ds CHS处理后对其致死效果,并比较4种dsRNA递送方式对其致死效果的影响,筛选获得防治效果明显的dsRNA及其递送方式。结果显示,处理48～168 h后,不同基因dsRNA处理组豌豆蚜的死亡率比阴性对照组高2.19倍～4.39倍,其中ds AK处理组豌豆蚜的死亡率为27.7%～91.1%,显著高于ds SOD、ds CHS处理组及阴性对照组。使用ds AK通过人工饲喂法和叶片注射饲喂法处理豌豆蚜,48 h即可出现显著致死效果。ds AK通过人工饲喂方法处理72 h后,豌豆蚜AK基因表达量比空白对照组降低43.2%,同时可抑制豌豆蚜的生长发育,使其体长比阴性对照组减少了5.9%。表明ds AK对豌豆蚜...     

青花菜抗坏血酸过氧化物酶基因BoAPX2的克隆与表达分析

 抗坏血酸过氧化物酶（Ascorbate peroxidase,APX）是H₂O₂清除剂,在植物抗逆反应中起着重要作用。根据NCBI发布的过氧化物体抗坏血酸过氧化物酶（Peroxisomal APX, pAPX）基因序列设计简并引物,分别以青花菜（Brassica oleracea var. italica）叶片DNA和cDNA为材料进行PCR扩增,克隆到一个APX基因,命名为BoAPX2,序列提交GenBank,登录号为JN172929。BoAPX2的基因组序列长为2 013 bp,具有8个内含子,编码区全长864 bp,编码287个氨基酸。序列分析结果表明,BoAPX2与已知的过氧化物体APX有较高的相似性,氨基酸的C端具1个跨膜结构域。RT-PCR结果表明,BoAPX2的表达受霜霉病菌（Hyaloperonospora parasitica）、H₂O₂、水杨酸和NaCl诱导。     

二化螟响应Bt杀虫蛋白Cry1Ca的小RNA转录组分析

为有效防控二化螟Chilo suppressalis,采用Illumina Solexa二代测序技术对Bt杀虫蛋白Cry1Ca处理后二化螟中肠内的小RNA序列进行测序,并对其差异表达谱进行注释与分析,并用实时荧光定量PCR技术对测序结果进行验证。结果显示,Cry1Ca对二化螟的亚致死量LC₃₀为0.061 μg/g。Cry1Ca处理和对照处理后转录组中小RNA分布峰值均为22 nt,被注释的已知小RNA比例很低,分别为7.2%和7.9%。Cry1Ca处理后,二化螟中肠内miRNA、snoRNA、snRNA、rRNA、piRNA数量均少于对照。与对照相比,Cry1Ca处理后二化螟中肠内共有358个小RNA表达上调,747个小RNA表达下调,其中有25个已知miRNA的表达量较高,其中3个已知miRNA表达量显著上调,22个已知miRNA表达量显著下调;在新预测的novel miRNA中,有23个上调表达,43个下调表达。KEGG分析结果显示,Cry1Ca诱导的miRNA影响了丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路,这个通路包含17个靶基因,其中11个靶基因可被多个miRNA调控,每个靶基因可被59~665个miRNA靶向调控,参与靶向调控miRNA的相对表达量变化倍数介于0.01倍~23 289倍之间,表明miRNA在调控二化螟防御Bt杀虫蛋白Cry1Ca方面发挥着重要作用。实时荧光定量PCR的结果与测序结果一致,表明测序结果正确。     

杀虫剂对转Bt水稻靶标害虫二化螟和非靶标害虫稻飞虱种群数量的影响

为明确杀虫剂对转Bt水稻品种华恢1号(Huahui 1,HH1)靶标害虫二化螟Chilo suppressalis及其非靶标害虫白背飞虱Sogatella furcifera和褐飞虱Nilaparvata lugens种群数量的影响,于2014—2015年在江西省南昌市南昌县莲塘镇的广福试验基地进行田间试验,种植转Bt水稻和对照亲本水稻,分别对其进行施用杀虫剂和未施用杀虫剂处理,然后对经2种处理后转Bt水稻和对照亲本水稻田中靶标害虫二化螟幼虫数量及非靶标害虫白背飞虱、褐飞虱的若虫数量、成虫数量、总虫量(若虫数量和成虫数量之和)进行调查,并对这3种害虫田间种群数量的年份、水稻品种、杀虫剂影响因子进行方差分析。结果显示,转Bt水稻种植对二化螟幼虫数量影响显著,而施用杀虫剂处理未显著影响二化螟幼虫数量。转Bt水稻种植对白背飞虱和褐飞虱的若虫数量、成虫数量和总虫量无显著影响;而施用杀虫剂处理显著降低转Bt水稻及其对照亲本水稻稻田内白背飞虱和褐飞虱的若虫数量及总虫量,并显著降低白背飞虱成虫数量。2014年和2015年,施用杀虫剂和未施用杀虫剂转Bt水稻田内二化螟幼虫数量极低或未调查到;未施用杀虫剂转Bt水稻上二化螟幼虫数量仅在2014年显著低于未施用杀虫剂对照亲本水稻。2014年,未施用杀虫剂转Bt水稻和对照亲本水稻上白背飞虱总虫量最大值分别为1 037、1 376头/百丛,施用杀虫剂后分别降低至233、253头/百丛;未施用杀虫剂转Bt水稻上和对照亲本水稻上褐飞虱总虫量最大值分别为4 120、2 413头/百丛,施用杀虫剂后降低至367、410头/百丛;2015年白背飞虱和褐飞虱的发生规律与2014年相同。表明转Bt水稻可显著降低二化螟幼虫数量,但褐飞虱及白背飞虱数量没有降低,而施用杀虫剂可有效降低褐飞虱及白背飞虱数量。     

2017—2019年江西省二化螟种群对四种杀虫剂的抗性

为明确近年来江西省二化螟种群对常用杀虫剂的抗性水平,提出合理化用药建议,本研究采用人工饲料浸药法测定2017—2019年江西省13个县(市)二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺、阿维菌素、三唑磷和杀虫单的抗性。结果表明,13个二化螟种群对氯虫苯甲酰胺的抗性水平整体为中等至高水平抗性,其中有11个二化螟种群对氯虫苯甲酰胺的抗性水平整体为上升趋势,在对氯虫苯甲酰胺抗性水平增加的种群中,都昌种群的抗性倍数从2017年的44.1倍上升至2018年的65.1倍,在2019年激增至高水平抗性,抗性倍数为283.5倍,为供试种群的最高抗性倍数。13个二化螟种群对阿维菌素的抗性水平整体为中等偏下,在对阿维菌素抗性水平增加的种群中,南昌种群的抗性倍数最高,2017—2019年分别为74.8倍、108.7倍和80.6倍。13个二化螟种群对三唑磷的抗性水平整体为中等偏下,其中新干、永修、万安、大余、上高和都昌这6个种群对三唑磷的抗性水平呈波动上升的趋势,而其他7个种群对三唑磷的抗性水平为波动性变化,偶有下降。13个二化螟种群对杀虫单的抗性水平整体为中等偏下并且有明显下降趋势,其中大余、永修、泰和、会昌、新干和上高这...     

不同地理种群二化螟对诱集植物香根草的选择趋性比较

为明确不同地理种群二化螟Chilo suppressalis对香根草选择趋性的差异,通过室内盆栽试验测定了3个省份共8个地理种群二化螟成虫对水稻和香根草的选择趋性及产卵选择性。结果表明:8个地理种群中,选择香根草栖息的二化螟雌、雄蛾比例分别为50%~70%和50%~80%。接入二化螟成虫后第1天,除温岭、乐清、萧山种群外,其它种群雌成虫对香根草和水稻的选择性存在显著差异。金华、衡阳、温岭、衢州种群雄成虫对香根草和水稻的选择性存在显著差异。接入二化螟成虫后第2天和第3天,所有种群雌成虫对香根草的选择性均显著高于对水稻的选择性。除乐清和萧山种群外,其它种群雄成虫对香根草的选择性也显著高于对水稻的选择性。8个不同地理种群二化螟在香根草上的产卵量比例为35%~70%,是水稻上产卵量的1.17(温岭)~2.33(衡阳)倍,均显著高于在水稻上的产卵量。结果表明,香根草对不同地理种群二化螟成虫均具有较好的诱集效果。     

二化螟Cry1Ac汰选品系对不同Bt蛋白的敏感性

为明确靶标害虫对Bt蛋白的抗性及对不同类型Bt蛋白的交互抗性,采用生物测定法进行了二化螟Chilo suppressalis(Walker)敏感品系和Cry1Ac汰选品系在Cry1Ac毒饲料上的时间-死亡率反应、对不同Bt杀虫蛋白的敏感性及不同Bt蛋白复配组合对二化螟毒力效果的研究。结果表明,二化螟Cry1Ac汰选品系已对36.67μg/mL(LC_(50))的Cry1Ac杀虫蛋白产生了一定的适应性,但对308.69μg/mL(LC90)的Cry1Ac蛋白反应仍较敏感。Cry1Ac敏感品系和汰选品系对Cry1Ab蛋白的LC_(50)分别为1.40μg/mL和3.86μg/mL,二者差异显著,但对Cry1Ca(1.63μg/mL和1.73μg/mL)或Cry2Aa(127.48μg/mL和144.50μg/mL)的LC_(50)差异不显著,即Cry1Ac汰选品系与Cry1Ab存在明显的交互抗性,但与Cry1Ca和Cry2Aa不存在交互抗性。在不同Bt蛋白复配组合中(1∶1复配),Cry1Ab+Cry1Ca、Cry1Ab+Cry2Aa和Cry1Ca+Cry2Aa增效作用最为显著。表明抗虫基因cry1Ca和cry2Aa可作为双价转基因抗虫水稻研发的候选基因。     

Fipronil resistance mechanisms in the rice stem borer, Chilo suppressalis Walker

Fipronil resistance mechanisms were studied between the laboratory susceptible strain and the selective field population of rice stem borer, Chilo suppressalis Walker in the laboratory. The borer population was collected from Wenzhou county, Zhejiang province. After five generations of selection, fipronil resistance ratio was 45.3-fold compared to the susceptible strain. Synergism experiments showed that the synergistic ratios of PBO, TPP and DEF on fipronil in susceptible and resistant strains of C. suppressalis were 7.55-, 1.93- and 2.91-fold, respectively, and DEM showed no obvious synergistic action on fipronil. Activities of carboxylesterase and microsomal-O-demethylase in the resistant strain were 1.89- and 1.36-fold higher that in susceptible strain, and no significant difference of glutathione-S-transferase activity was found between the resistant and susceptible strains. The K_m and V_max experiments also demonstrated that fipronil resistance of C. suppressalis was closely relative to the enhanced activities of carboxylesterase and microsomal-O-demethylase. Moreover, cross-resistance between fipronil and other conventional insecticides and the multiple resistant properties of the original Wenzhou’s population were also discussed.     

Effects of pyrethroids and endosulfan on fluidity of mitochondria membrane in Chilo suppressalis (Walker)

The effects of pyrethroids and endosulfan on fluidity of mitochondrial membranes from Chilo suppressalis were investigated at different temperatures by steady-state fluorescence polarization using 1,6-diphenyl-1,3,5-hexatriene (DPH) molecule as probe. The results showed that changes in DPH polarization caused by the pyrethroids tested were more at lower temperature than at higher temperature, which showed a negative temperature coefficient of the pyrethroids. On the contrary, change in DPH polarization caused by endosulfan was more at higher temperature than at lower temperature. Endosulfan displayed a positive temperature coefficient. Moreover, these effects of pyrethroids and endosulfan on changes of DPH polarization were dose-dependent in mitochondrial membranes of C. suppressalis. DPH polarization value increased in the mitochondrial membranes treated by all concentrations of pyrethroids and decreased by endosulfan, and changes caused by pyrethroids were more pronounced than by endosulfan.     

Triazophos resistance mechanisms in the rice stem borer (Chilo suppressalis Walker)

A field population of the rice stem borer (Chilo suppressalis Walker) with 203.3-fold resistance to triazophos was collected. After 8-generation of continuous selection with triazophos in laboratory, resistance increased to 787.2-fold, and at the same time, the resistance to isocarbophos and methamidophos was also enhanced by 1.9- and 1.4-fold, respectively, implying some cross-resistance between triazophos and these two organophosphate insecticides. Resistance to abamectin was slightly enhanced by triazophos selection, and fipronil and methomyl decreased. Synergism experiments in vivo with TPP, PBO, and DEM were performed to gain a potential indication of roles of detoxicating enzymes in triazophos resistance. The synergism results revealed that TPP (SR, 1.92) and PBO (SR 1.63) had significant synergistic effects on triazophos in resistant rice borers. While DEM (SR 0.83) showed no effects. Assays of enzyme activity in vitro demonstrated that the resistant strain had higher activity of esterase and microsomal O-demethylase than the susceptible strain (1.20- and 1.30-fold, respectively). For glutathione S-transferase activity, no difference was found between the resistant and the susceptible strain when DCNB was used as substrate. However, 1.28-fold higher activity was observed in the resistant strain when CDNB was used. These results showed that esterase and microsomal-O-demethylase play some roles in the resistance. Some iso-enzyme of glutathione S-transferase may involve in the resistance to other insecticides, for this resistant strain was selected from a field population with multiple resistance background. Acetylcholinesterase as the triazophos target was also compared. The results revealed significant differences between the resistant and susceptible strain. The V_max and K_m of the enzyme in resistant strain was only 32 and 65% that in the susceptible strain, respectively. Inhibition tests in vitro showed that I₅₀ of triazophos on AChE of the resistant strain was 2.52-fold higher. Therefore, insensitive AChE may also involved in triazophos resistance mechanism of rice stem borer.     

转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对田间稻纵卷叶螟和二化螟及其捕食性天敌的影响

为研究转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号对稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis和二化螟Chilo suppressalis及其捕食性天敌的影响,采用剥查法和吸虫法,于2012—2013年在江西省南昌县调查了赣绿1号田间稻纵卷叶螟与二化螟的发生为害情况及其捕食性天敌拟环纹豹蛛Pardosa pseudoannulata和拟水狼蛛Pirata subpiraricus的种群动态。结果表明,与非转基因亲本9311水稻相比,在2012和2013年螟虫为害高峰期,赣绿1号田间稻纵卷叶螟百株虫量分别减少57.78头和27.78头,卷叶率分别降低20.46%和6.50%;二化螟百株虫量分别减少24.44头和152.22头,枯心/白穗率分别降低13.02%和14.20%。此外,赣绿1号与9311水稻田间拟环纹豹蛛和拟水狼蛛的种群动态趋势基本一致。研究表明,转cry1Ab/cry1Ac基因水稻赣绿1号能有效控制稻纵卷叶螟和二化螟,而对其捕食性天敌拟环纹豹蛛和拟水狼蛛无显著影响。