棉铃虫BR-C Z4基因的克隆及表达分析

为明确转录因子广泛锌指复合物（broad-complex,BR-C）Z4亚型在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育过程中的作用,基于2-十三烷酮（2-tridecanone,2-TD）处理的棉铃虫幼虫中肠转录组数据克隆获得BR-C Z4的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,对其氨基酸序列和编码蛋白质进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR）技术分析BR-C Z4基因在棉铃虫不同龄期、不同组织和2-TD处理6龄幼虫中的表达规律以及其和Ⅳ型几丁质酶（chitinase IV,CHT4）编码基因在4~6龄初、末期幼虫中的表达规律。结果表明,克隆获得的棉铃虫BR-C Z4基因的ORF为1 347 bp,编码448个氨基酸,预测编码蛋白质的分子量和理论等电点分别为49.8 kD和7.75,且主要定位于细胞核中。系统进化分析结果显示,棉铃虫BR-C Z4与家蚕Bombyx mori和烟草天蛾Manduca sexta的BR-C Z4亲缘关系最近。BR-C Z4基因在棉铃虫整个生长期均有表达,在3龄期的相对表达量最低而在预蛹期的相对表达量最高;该基因在棉铃虫6龄幼虫的脂肪体、中肠、体壁和头部均有表达,在头部的相对表达量最低,在中肠中的相对表达量最高; BR-C Z4和CHT4基因在棉铃虫4~6龄末期幼虫中的相对表达量均显著高于4~6龄初期幼虫;相关性分析结果显示BR-C Z4和CHT4的相对表达量呈极显著正相关;随着2-TD处理浓度的增加,棉铃虫BR-C Z4基因的相对表达量总体呈现先上升后下降的趋势,其中15 mg/g浓度处理20 h时BR-C Z4基因相对表达量达到峰值,而20 mg/g浓度处理6 h时BR-C Z4基因相对表达量降到最低,为对照的22.73%。推测BR-C Z4基因在棉铃虫变态发育和应对2-TD胁迫过程中发挥着重要作用。     

棉铃虫表皮蛋白基因CP22和CP14的表达特征及其对甲氧虫酰肼的响应

为揭示棉铃虫Helicoverpa armigera表皮蛋白（cuticular protein，CP）基因在其生长发育及应对药剂胁迫中的作用，克隆棉铃虫2个CP基因CP22和CP14，利用实时荧光定量PCR技术分析其在不同发育阶段和不同组织中的相对表达量，并于显微镜下观察甲氧虫酰肼亚致死剂量处理后棉铃虫3龄幼虫的表皮形态，并用实时荧光定量PCR技术测定药后CP22和CP14基因的相对表达量。结果显示，CP22和CP14的开放阅读框全长分别为570 bp和393 bp，分别编码189个和130个氨基酸；CP22和CP14都具有1个几丁质结合域，属于CPR家族RR-1亚类；CP22和CP14基因均在棉铃虫5龄幼虫表皮中表达水平高；这2个基因在棉铃虫幼虫期的表达水平高于在卵期、蛹期和成虫期的表达水平，且在4龄幼虫体内表达量最高，在蜕皮后随着日龄的增加表达量逐渐降低；甲氧虫酰肼处理后棉铃虫3龄幼虫表皮黑化、皱缩，发生蜕皮异常，显微观察显示其内外表皮分离，真皮细胞解体；甲氧虫酰肼处理后24 h和48 h，棉铃虫CP22和CP14基因的相对表达量显著上调。表明棉铃虫CP22和CP14基因参与棉铃虫幼虫蜕皮，并且响应甲氧虫酰肼胁迫，可作为防治棉铃虫的潜在靶标基因。     

棉铃虫BR-C Z2基因的克隆、原核表达及其表达谱

为明确转录因子广泛锌指复合物（broad complex,BR-C）在棉铃虫Helicoverpa armigera生长发育过程中的作用,基于转录组序列从棉铃虫幼虫中肠克隆获得BR-C Z2的cDNA序列并对其氨基酸序列和蛋白结构进行生物信息学分析,利用原核表达系统表达其融合蛋白;用实时荧光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR）技术分析BR-C Z2基因在棉铃虫体内的表达规律,以及2-十三烷酮（2-tridecanone,2-TD）处理后其在棉铃虫6龄幼虫中肠内的变化规律。结果显示,棉铃虫BR-C Z2基因的开放阅读框为1 257 bp,编码418个氨基酸,预测编码蛋白的分子量和理论等电点分别为46.63 kD和6.94,主要定位于细胞核中。系统进化树结果显示棉铃虫BR-C Z2与家蚕Bombyx mori的BR-C Z2亲缘关系最近。成功表达His-HaBR-C Z2融合蛋白。BR-C Z2基因在棉铃虫蛹期和6龄幼虫中肠组织中相对表达量最高;不同浓度2-TD处理后,棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量变化趋势不同,其中15 mg/g浓度处理12 h后棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量达到峰值,是对照的2.5倍,而20 mg/g浓度处理20 h后棉铃虫BR-C Z2基因相对表达量降到最低,为对照的45.13%。表明BR-C Z2基因可能参与棉铃虫的生长发育,并响应2-TD的胁迫。     

棉铃虫YTHDF1基因的表达模式及在核型多角体病毒侵染中的作用

为明确N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine,m⁶A）修饰在棉铃虫核型多角体病毒（Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus,HearNPV）侵染棉铃虫中的作用,根据基因组和转录组数据,对棉铃虫m⁶A结合蛋白基因YTHDF1（YTH domain-containing family protein 1）进行鉴定和分析,利用实时荧光定量PCR技术检测棉铃虫YTHDF1基因的时空表达模式、HearNPV处理后的表达变化情况以及RNA干扰效率,并调查该基因下调后对HearNPV复制及感染HearNPV棉铃虫死亡情况的影响。结果显示,棉铃虫YTHDF1基因开放阅读框全长为2 019 bp,编码672个氨基酸,含有1个保守的YTH结构域,其氨基酸序列与斜纹夜蛾Spodoptera litura同源物序列一致性达87.52%。YTHDF1基因在棉铃虫不同发育阶段均有表达,其中在进入5龄期24 h幼虫中的表达量最高,在2龄取食期幼虫中的表达量最低。YTHDF1基因的空间表达谱呈现一定的组织特异性,在幼虫血细胞和成虫头部的表达量最高。HearNPV侵染棉铃虫后YTHDF1基因上调表达,经RNA干扰使该基因下调后显著抑制了HearNPV多角体蛋白基因polyhedrin的表达并延迟了感染HearNPV棉铃虫的死亡时间。表明YTHDF1基因在HearNPV侵染棉铃虫的过程中发挥着重要作用。     

棉铃虫过氧化物还原酶基因Prx4的鉴定及功能分析

为探究过氧化物还原酶（peroxiredoxin,Prx）在棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫体内的功能,利用转录组数据鉴定得到了棉铃虫Prx4基因,并对其进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）测定该基因在棉铃虫不同发育阶段和5龄幼虫不同组织中的相对表达,利用原核表达和RNA干扰方法探究该基因的功能。结果表明,Prx4基因开放阅读框长为744 bp,编码248个氨基酸,系统进化树和同源序列多重比对结果显示该基因属于典型的2-Cys过氧化物酶家族;Prx4基因广泛分布于棉铃虫幼虫各组织和发育阶段中;当感染核型多角体病毒（nucleopolyhedrovirus,NPV）后,棉铃虫Prx4基因相对表达量上调;重组蛋白的体外试验表明Prx4蛋白具有一定的抗氧化活性;与对照相比,小干扰RNA处理6、8和10 d后感病棉铃虫的死亡率分别较对照显著提高了4.46%、22.42%和38.68%。表明Prx4基因作为一种抗氧化酶保护棉铃虫免受氧化损伤,同时在抵御NPV感染过程中发挥着重要的免疫作用。     

沙葱萤叶甲己糖激酶基因的克隆、相对表达量及RNA干扰效应

为揭示沙葱萤叶甲Galeruca daurica己糖激酶基因的功能,根据本课题组组装的沙葱萤叶甲转录组测序数据,应用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends,RACE）克隆获得沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长序列,分析其编码蛋白的氨基酸序列与其它昆虫同源蛋白氨基酸序列之间的系统进化关系,采用实时荧光定量技术（real-time quantitative polymerasechain reaction,qPCR）测定不同发育阶段和不同温度下沙葱萤叶甲己糖激酶基因的相对表达量以及对RNA干扰的响应。结果表明,沙葱萤叶甲己糖激酶基因的cDNA全长为1 699 bp,开放阅读框长为1 479 bp,编码492个氨基酸;沙葱萤叶甲己糖激酶氨基酸序列与玉米根萤叶甲Diabrotica virgifera virgifera己糖激酶氨基酸序列一致性最高,为65.42%。己糖激酶基因在沙葱萤叶甲不同发育阶段均有表达,成虫滞育期间相对表达量维持在低水平,而滞育结束后相对表达量急剧上升达最高值。在0~40℃范围内,随着温度增加,己糖激酶基因在沙葱萤叶甲成虫体内相对表达量呈先升高后下降的趋势。采用RNA干扰技术沉默沙葱萤叶甲成虫己糖激酶基因2 d后,与对照相比,己糖激酶基因相对表达量下调90%以上,4 d后仍下调40%以上;该基因干扰后12 d内,沙葱萤叶甲成虫存活率下降了25%以上。表明己糖激酶基因可能在沙葱萤叶甲生长发育和滞育过程中起着重要作用。     

多杀霉素亚致死浓度对棉铃虫幼虫生理及代谢的影响

为明确田间使用多杀霉素亚致死浓度对棉铃虫Helicoverpa armigera幼虫的影响,用含多杀霉素亚致死浓度LC₂₅的人工饲料持续饲喂棉铃虫3龄幼虫,并对饲喂后其体重、取食量、累计蛹化率、蛹发育历期和蛹重等生长发育及脂肪体内甘油三脂（triglyceride,TG）含量和相关基因SREBP、FAS和HSL表达情况进行测定。结果表明,多杀霉素对棉铃虫的亚致死浓度LC₂₅为0.21 mg/kg;多杀霉素亚致死浓度处理4~6 d后,棉铃虫3龄幼虫体重分别为0.065、0.263和0.329 g,较对照显著降低;处理6 d后,其取食量为0.082 g,较对照显著降低;处理4~7 d后,其累计化蛹率分别为60.90%、63.20%、65.50%和65.50%,较对照显著降低。多杀霉素亚致死浓度处理后,棉铃虫蛹发育历期由对照9.89 d显著延长至10.74 d,单头蛹重为0.274 g,显著低于对照的0.324 g;其脂肪体TG含量较对照显著降低。多杀霉素亚致死浓度处理24~72 h后,参与脂肪酸合成信号通路中重要基因SREBP和FAS的相对表达量较对照均显著下调,而参与脂肪代谢的重要基因HSL则较对照显著上调。     

黏虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆及抗球孢白僵菌功能分析

为探究丝氨酸蛋白酶抑制剂（serine protease inhibitor,Serpin）基因在黏虫Mythimna separata生长发育及免疫防御等过程中发挥的作用,在黏虫转录组中获得Serpin基因的cDNA序列,采用实时荧光定量PCR技术分析Serpin在黏虫不同发育阶段和不同组织中的表达水平,并通过RNA干扰技术分析Serpin在黏虫抗球孢白僵菌Beauveria bassiana过程中发挥的作用。结果显示,获得2个黏虫Serpin基因,命名为MsSerpin-4和Mserpin-5,其cDNA全长序列分别为1 938 bp和2 618 bp,开放阅读框分别为1 188 bp和1 197 bp,分别编码395个和398个氨基酸,GenBank登录号分别为MZ577062和MZ577063。2个基因在黏虫不同龄期和不同组织内均有表达,在成虫期的相对表达量最高,在1龄幼虫期的相对表达量最低;在中肠中的相对表达量最高,在唾腺中的相对表达量最低。RNA干扰6 h时对MsSerpin-4和Mserpin-5表达的抑制效果最好,抑制率分别为52.57%和49.15%;MsSerpin-4和Mserpin-5的表达被抑制后,黏虫对球孢白僵菌更敏感,校正死亡率分别提高了31.47%和14.62%。表明黏虫2个MsSerpin均参与了被球孢白僵菌侵染后的免疫反应,可为后续黏虫的生物防治提供新靶标。     

入侵害虫松树蜂嗅觉共受体SnocOrco基因的鉴定及其表达模式分析

为探究我国重大入侵害虫松树蜂Sirex noctilio的嗅觉分子机制,通过RT-PCR技术克隆松树蜂嗅觉共受体SnocOrco基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,且采用qPCR技术明确SnocOrco在组织中的特异性表达谱和时空表达特性。结果表明,SnocOrco基因（GenBank登录号：MK748989）开放阅读框全长1 446 bp,编码481个氨基酸,氨基酸序列具有7个跨膜螺旋结构和1个高度保守结构功能域Pfam：7tm_6。SnocOrco属于稳定的疏水性膜蛋白,同源性比对和系统发育分析结果显示,氨基酸序列与膜翅目、鳞翅目、鞘翅目和双翅目其它昆虫的Orco都具有很高的同源性,其中与麦茎蜂Cephus cinctus的CcinOrco同源性最高,达到87.14%,在系统发育树中聚为一支。qPCR结果显示,SnocOrco主要在雌、雄成虫触角中高表达,约为外生殖器中表达量的6 000倍和4 000倍,且在雌成虫中的表达量高于雄成虫中的表达量;在2~7日龄成虫触角中SnocOrco的相对表达量在2日龄时达到最高,之后随着日龄的增加呈下降趋势;昼夜节律显示,SnocOrco相对表达量从9：00—15：00呈先上升后下降的趋势,在11：00时达到最高。表明SnocOrco基因在松树蜂两性交流中起着重要作用。     

Antagonismusin vitro vonBacillus spp. gegenüberRhizoctonia solani undPythium spp.

Es konnten 132Bacillus-Stämme isoliert und gegenüber7 Rhizoctonia-solani- und 6Pythium-Stämmen auf Antagonismusin vitro untersucht werden. Die gefundenen Antagonisten hemmten die Pilzisolate unterschiedlich stark, so daß Gemische von Antagonisten für die Praxis zu empfehlen sind.There were 132Bacillus-strains isolated and tested for antagonism against 7 strains ofRhizoctonia solani and 6 strains ofPythium spp. The isolated antagonists didn't show a uniform effect against the tested strains ofRhizoctonia solani andPythium spp. For an application in practice it will be better to use a mixture of antagonists.

---

Mit 4 Abbildungen und einer Tabelle     

Antagonismusin vivo vonBacillus spp. gegenüberRhizoctonia solani undPythium spp.

Es konntenBacillus-Isolate gefunden werden, die sich in Keimungsversuchen an Samen als antagonistisch gegenüberPythium aphanidermatum undRhizoctonia solani erwiesen. Die Versuche wurden mit Bohnen- und Gurkensamen durchgeführt. Die wirksamsten Antagonisten konnten in infizierter Erde Auflaufraten bei Gurken von 40–60% erzielen.Die Wirksamkeit der Antagonisten an Bohnen war niedriger, hier lagen die Keimraten kaum höher als 30%. Offenbar hängt die Wirksamkeit derBacillus-Antagonisten von der Fähigkeit ab Antibiotika zu produzieren und in Konkurrenz zu anderen Mikroorganismen zu treten.     

小麦全蚀病菌病毒的研究

 自山东泰安及烟台地区的小麦全蚀病菌中提取到两种类型颗粒,一类是球形至多边形的病毒颗粒,直径在22~45毫微米之间,多数为27~32毫微米;另一类是棒状颗粒,长度为40~185毫微米×16毫微米,平均108×16毫微米,提取的球形病毒具有核蛋白的典型吸收光谱,最大和最小吸收值的波长分别在260毫微米和240毫微米,A260/240=1.24,A260/280=1.62。以烟台株病毒制备的抗血清,分别与烟台及泰安株病毒在琼脂免疫双扩散中作用均产生沉淀线,表明二者具有共同的血清型。烟台株病毒经苯酚抽提后的核酸样品最大吸收波长是260毫微米,最小是230毫微米,经聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶电泳分离为两条迁移率相近的带,表明此病毒有两个基因片断,在分类上属于需要两个dsRNA片断才能复制的等轴dsRNA真菌病毒。其外壳蛋白经测定含分子量70,000的多肽。<>br从浙江、湖北等11个省(市)的12株全蚀病菌中均提取到了病毒,比较了各菌的菌落颜色,生长速度和病毒浓度。     

玫烟色虫草和球孢白僵菌对朱砂叶螨和二斑叶螨的致病力评价

为探寻具有杀螨潜力的生防真菌,采用喷雾法测定分析玫烟色虫草Cordyceps fumosorosea IF-1106菌株和球孢白僵菌Beauveria bassiana BB-1339菌株对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus和二斑叶螨Tetranychus urticae卵、幼螨及雌成螨的致病力。结果表明,感染玫烟色虫草IF-1106菌株和球孢白僵菌BB-1339菌株后螨类的形态特征不一致,感染IF-1106菌株后形成棉絮状菌丝,而感染BB-1339菌株后则形成羊毛状菌丝。IF-1106菌株和BB-1339菌株对朱砂叶螨和二斑叶螨卵的LC₅₀分别为2.38×10⁷、8.26×10⁷CFU/mL和4.48×10⁷、1.21×10⁸CFU/mL,对朱砂叶螨和二斑叶螨幼螨的LC₅₀分别1.97×10⁷、8.26×10⁷CFU/mL和7.65×10⁶、8.99×10^5...     

玉米种质资源对丝轴团散黑粉菌的抗性筛选

<正>近年来随着玉米产业不断壮大和发展,轮作倒茬日益困难,加之感丝黑穗病品种或制种亲本的大面积种植,致使玉米丝黑穗病呈加重趋势(李莉等,2012)。筛选和培育抗病品种是病害防治的有效手段,而鉴定和评价育种亲本的抗病性则是选育抗病品种需要解决的首要问题。目前,通过田间接种鉴定筛选出一批高抗自交系,如KH23(高卫东等,     

The use of Verticillium dahliae and Diplodia scrobiculata to induce resistance in Pinus halepensis against Diplodia pinea infection

The pathogenic fungi Verticillium alboatrum and Diplodia scrobiculata were assayed for biological control of Diplodia pinea on Aleppo pine (Pinus halepensis) in Catalonia (north-eastern Spain). Young shoots were pre-treated with inoculations of either V. dahliae or D. scrobiculata, by placing colonized agar plugs on wounds made by removing a single needle fascicle. An inoculation with D. pinea was performed 15 days later. Two months after the shoot inoculations, the canker length on the stems was measured and the percentage of shoot dieback calculated. Verticillium dahliae and D. scrobiculata were found to significantly reduce the canker length of D. pinea (P < 0.05) when compared with positive controls. Diplodia pinea was slightly more sensitive to V. dahliae than to D. scrobiculata, but no significant differences (P > 0.05) were observed in the mean canker length between the two treatments. Trees pre-inoculated with V. dahliae resulted in 31.12% shoot dieback, while those pre-inoculated with D. scrobiculata resulted in 32.18% shoot dieback, compared with positive controls (42.85%).     

欧亚种葡萄自交F1代对白粉病和霜霉病的抗性遗传

采用田间自然鉴定、田间接种鉴定及室内离体叶圆片接种鉴定三种方法,研究了10个欧亚种葡萄品种(系)、一个欧山杂种及其493株自交后代幼苗对葡萄霜霉病及白粉病的抗性及遗传关系,同时对其自交后代抗白粉病和霜霉病的遗传趋势进行了分析.结果表明,供试品种(系)及其自交后代对霜霉病与白粉病的抗性存在极显著相关,自交后代对两病表现伴随遗传现象,初步推断这可能是由葡萄抗病基因的多效性引起.在欧亚种葡萄品种自交后代群体中,虽然90%以上都是感病性中等或高的类型,但仍能够得到一定比例(10%以下)抗病性强的类型,这为利用欧亚种葡萄品种进行自交或品种间杂交选育优质抗病新品种提供了依据.     

水稻条斑病菌rsmA基因在致病性中的功能分析

RsmA属于CrsA/RsmA蛋白家族成员,是一类RNA结合蛋白,作为一类全局性的转录后调控因子,调控碳代谢、生物膜形成、游动性以及致病性相关基因的表达等。同源性搜索结果显示,水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc)RS105中存在rsmA基因,其与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)PXO99A的rsmAXoo同源性为100%。但是,r smAXoc基因在致病性中的功能未知。本研究构建了Xoc的rsmA缺失突变体RΔrsmA。寄主水稻和非寄主烟草接种结果显示,RΔrsmA在水稻上仍具有致病性,在非寄主烟草上也能够激发HR反应,这些结果与已鉴定的Xoo rsmA突变体表型不一致。但是,与野生型菌株相比,RΔrsmA在感病水稻上的毒性显著降低;在丰富和贫乏的培养基中,RΔrsmA的生长能力也明显减弱。其他毒性相关表型的测定结果显示,与野生型菌株相比,RΔrsmA在半固体培养基上的游动能力减弱,生物膜形成能力增强,胞外多糖产量明显降低,胞外蛋白酶的活性增加。这些结果暗示在Xoc中rsmA为重要的毒性相关基因,在Xoo和Xoc中RsmA在致病性中的功能存在一定的差异,RsmA下游调控基因的鉴定可能为解析其在2个水稻致病变种中功能的差异提供线索。     

异色瓢虫对雪松长足大蚜的捕食作用

为明确异色瓢虫Harmonia axyridis对雪松长足大蚜Cinara cedri的捕食能力,采用捕食功能反应方法在室内测定了异色瓢虫各龄幼虫和成虫对雪松长足大蚜4龄若蚜的捕食功能反应、寻找效应、种内干扰效应及环境温度对其捕食能力的影响。结果显示:异色瓢虫各龄幼虫和成虫对雪松长足大蚜若蚜的捕食功能反应类型均属于Holling II型,成虫对雪松长足大蚜的捕食能力强于幼虫,幼虫的捕食能力随虫龄的增大而增强,1～4龄幼虫及成虫的日最大捕食量分别是11.41、41.32、61.73、140.85、188.68头;异色瓢虫1～4龄幼虫及成虫对雪松长足大蚜4龄若蚜的寻找效应随猎物密度的增加而下降,二者之间呈线性相关,相关系数为0.9758～0.9993,其中2龄幼虫的搜寻效应随猎物密度的增加,下降趋势最大,成虫则下降趋势最小;异色瓢虫成虫的捕食受到较强的种内干扰,在猎物密度和捕食空间一定的情况下,单头日平均捕食量随其自身密度的增加而降低,二者间关系符合模型A=58.8391x~(-0.3313);异色瓢虫的捕食受环境温度影响明显,在15～35℃范围内,其成虫对雪松长足大蚜的捕食量先增加后减少,25℃是异色瓢虫最适宜的捕食温度。表明异色瓢虫对雪松长足大蚜有很强的捕食能力,尤其是成虫和高龄幼虫,但应用时还需考虑温度因素的影响。