望江南中核糖体失活蛋白新基因CassinⅠ的克隆及特征分析

【目的】克隆在植物抗病虫过程中具有重要作用的核糖体失活蛋白新基因,为该类蛋白基因功能研究和有效利用创造条件。【方法】通过分析多种不同来源的植物核糖体失活蛋白的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1和P2,对药用植物望江南基因组进行PCR扩增,获得一种新的RIP基因片段。通过RACE法,获得了其全长cDNA序列-CassinⅠ。【结果】CassinⅠ基因全长为882 bp,其推导的氨基酸序列与葫芦科两个代表核糖体失活蛋白β-luffin和Trichosanthin（TCS）的相似性分别为58.2%和34.7%,与GenBank中其它核糖体失活蛋白的序列无显著相似性。多重序列比对发现：CassinⅠ有9个氨基酸残基与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,另外两个残基发生了变化。所有的活性位点都在P1/P2扩增区段内。【结论】首次在望江南中克隆和报道一种新的核糖体失活蛋白基因,为进一步研究该基因的功能、并应用于作物转基因抗病虫害育种研究奠定了基础。     

6个植物核糖体失活蛋白新基因片段的克隆及特征分析

通过分析多种不同来源的植物RIPs的氨基酸序列,据其保守区域设计1对植物通用简并引物P1、P2,对基因组进行PCR扩增,分别从海芋Araceae macrorrhiza,烟草Nicotiana tobaccum、剑麻Agavaccae aga-ve、望江南(Cassia occidentalis、那坡指天蕉Musa spp.(BB)、邻水野蕉Musa spp.(AA)中获得1个基因片段.BLAST分析表明:它们推导的氨基酸序列只与多种不同来源的RIPs有相似性.其中,与葫芦科2个代表RIP相应区段的相似性最高,与β-luffin基因的相似性分别为97.2%、98.5%、97.9%、89.4%、97.9%、97.2%,与天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的相似性分别为63.6%、64.5%、64.1%、60.8%、64.8%、和63.6%.多重序列比对发现:6个序列中分别有10、9、11、11、9、10个残基氨基酸与TCS的N-糖苷酶活性位点的残基完全相同,只是残基位置不一致,仅有个别残基发生了变化.所有的N-糖苷酶活性位点都在P1/P2扩增区段内.     

水稻核糖体蛋白（OsRPL14）基因的克隆及表达分析

通过荧光差异显示（fluorescent differential display,FDD）以及RT-PCR技术,得到一个水稻核糖体蛋白基因。该基因的cDNA全长为565bp,编码一个具有134个氨基酸残基的多肽,推测分子量是15.4kD。与其他植物中核糖体蛋白L14的相似性为82.84%～88.06%,命名该基因为OsRPL14。在低温（8℃）及干旱条件处理下,该基因表达量在根和茎中都有比较明显的增加趋势。推测该基因在逆境反应中起着重要作用。     

核糖体失活蛋白(α-MC)亚细胞定位及对TMV的抑制作用

【目的】克隆获得苦瓜α-MC、商陆PAP,在烟草中异源表达观察两个蛋白在细胞中的定位情况。研究α-MC对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)的抑制作用及其引起的抗性防御反应。【方法】根据已报道的商陆抗病毒蛋白PAP基因全序列和苦瓜素基因全序列,设计并合成扩增PAP和α-MC基因全长引物,通过RT-PCR及基因克隆方法,从苦瓜和商陆春叶克隆得到苦瓜α-MC、商陆PAP;用Wolf PSORT预测蛋白定位,将苦瓜α-MC、商陆PAP分别融合在GFP和Ds Red2的N端,构建融合蛋白表达载体,采用GFP和Ds Red2标记进行亚细胞定位,验证预测结果;通过农杆菌介导在本氏烟中瞬时表达α-MC,再接种烟草花叶病毒,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分别检测病毒在接种叶片的蛋白积累量和RNA表达量,分析瞬时表达α-MC的抗病毒效果。利用q RT-PCR分析植物防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,探究其抗病毒机理。【结果】克隆得到基因α-MC和PAP全长,分别为861和939 bp。Wolf PSORT预测显示α-MC和PAP主要定位于细胞质膜上。共聚焦荧光显微镜下观察发现,分别用GFP和Ds Red2标记的α-MC和PAP均定位在本氏烟叶片表皮细胞质膜上,与Wolf PSORT预测的α-MC和PAP定位结果相一致。异源表达的PAP对植物细胞毒性作用强,导致表达部位细胞坏死,异源表达α-MC的植物细胞无明显毒性,表达部位细胞完整。在本氏烟中异源表达α-MC后,再接种TMV-GFP,在紫外灯下观察发现α-MC处理后的本氏烟在接种TMV-GFP 48 h后没有出现绿色荧光,而对照组出现荧光。72 h后处理组出现零星荧光,但对照组的绿色荧光开始扩散,连续观察,处理组几乎没有变化,接种TMV-GFP 6 d后,发现处理组的绿色荧光几乎没有扩大的趋势,而对照组的绿色荧光已扩散至心叶;ELISA检测表明,在接种TMV-GFP 6 d后的叶片中,对照组与健康植物的OD492比值几乎已达到处理组的10倍以上;q RT-PCR检测TMV RNA的含量,结果显示对照组TMV RNA表达量是处理组的149倍左右,表明α-MC对TMV复制和移动均有明显抑制;q RT-PCR结果分析显示,NPR1在只注射TMV、单独表达α-MC以及表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均被诱导表达,但后者的表达量是前两个处理的约2.5倍左右,在只接种α-MC和表达α-MC后注射TMV的本氏烟中均检测到PR1、PR2,但后者的表达量显著高出前者5—7倍,表明异源表达α-MC可诱导植物中防卫相关基因NPR1、PR1、PR2的表达,从而引起更强的防御反应。【结论】异源表达α-MC显著抑制TMV,能够激活植物防卫反应,且对植物细胞无明显毒性。研究结果为利用异源表达α-MC方法开发控制植物病毒新产品提供了参考依据。     

栝楼籽核糖体失活蛋白的纯化及性质研究

用改进的方法从栝楼籽制得一种单链核糖体失活蛋白,研究其性质,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＩＥＦ显示为单一条带,分子量为２９ｋＤ,ｐＩ≥９．３,含糖量约为１．７５％。在兔网织红细胞裂解液系统中对蛋白质合成有较强的抑制活性ＩＣ５０为６．７＊１０＾－１０ｍｏｌ／Ｌ。     

巴西橡胶树LIM结构域基因克隆与生物信息学分析

根据乙烯利刺激巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)胶乳差异表达cDNA文库的EST序列信息,利用RACE技术从胶乳中成功克隆了1个含有LIM结构域的未知功能新基因HbLIM的全长cDNA。生物信息学分析表明,该基因全长cDNA由1016bp的碱基组成,拥有1个570bp的开放阅读框编码189个氨基酸残基;推测氨基酸序列富含Lys,Ser,Ala和Leu,含有2个LIM结构域和2个N-豆蔻酰化位置。序列相似性分析表明,HbLIM编码的氨基酸序列与蓖麻、杨毛、葡萄相应的LIM基因的相似性高达98%,95%和92%。这些研究结果为深入探讨LIM结构域蛋白在巴西橡胶树乳管发育及乳管代谢中的功能奠定了基础。     

甘蓝型油菜生物素羧基载体蛋白基因的克隆与结构分析

 【目的】生物素羧基载体蛋白负责将羧基从生物素羧化酶转移到羧基转移酶上，对于长链脂肪酸的从头合成与种子含油量的形成具有十分重要的作用。本研究的目的是从甘蓝型油菜品种基因组DNA中分离生物素羧基载体蛋白（BCCP）基因的全长编码区序列，通过生物信息学分析揭示该基因的结构特征（包括内含子的数量、长度与分布，蛋白质保守区疏水性特征等）和功能关系。【方法】基因克隆采取同源序列法进行。【结果】分离得到的bccp基因全长均为1 600 bp左右，根据其结构特点可以分成3种类型，它们均包含5个内含子。bccp1基因编码的蛋白质具备完整的生物素化功能结构域，是唯一功能完整的基因序列；bccp2和bccp3由于移码突变造成蛋白合成提前终止，翻译的蛋白质均缺少生物素化结构域。【结论】本研究首次从中国冬油菜品种中克隆获得bccp基因的全长序列并揭示了其序列特征，为进一步利用该基因开展含油量的基因调控研究提供了科学依据。     

蓖麻RcAKT1基因的克隆与序列分析

[目的]对蓖麻Rc AKT1基因进行克隆和序列分析。[方法]提取盐胁迫处理的蓖麻新鲜叶片总RNA,采取RACE法克隆蓖麻Rc AKT1基因的3'末端和5'末端,利用生物信息学软件DNAman对两端序列进行拼接,最后设计一对特异性引物,从而获得蓖麻Rc AKT1基因的ORF全长序列,并对该序列进行生物信息学分析。[结果]该基因的开放阅读框序列长度为2 253 bp,推测可不间断编码751个氨基酸。选取其他植物的AKT1序列与蓖麻Rc AKT1序列进行比对,结果显示同源性很高,其一致性在84%~97%。[结论]经过生物信息学分析,发现蓖麻Rc AKT1属于ANK超级家族,是亲水性蛋白质。     

南瓜基因CmNAC的克隆与序列分析(英文)

[目的]克隆南瓜基因CmNAC并进行序列分析。[方法]以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC和辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析。[结果]所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC;该基因片段具有其它植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。[结论]实验拟在南瓜中获得和抗逆性相关的NAC基因,为进一步研究该基因的生物学功能和植物基因工程奠定理论基础。     

番茄褪绿病毒郑州分离物外壳蛋白基因的克隆与序列分析

近年来郑州番茄产区发现疑似番茄褪绿病毒(To CV)侵染引起的叶脉间褪绿症状,为了确定病原种类,采集典型症状的叶片,提取RNA,根据已知的To CV基因组序列设计特异性引物To CVCPF/To CVCPR,采用RT-PCR方法对样品进行检测,扩增得到约750 bp大小的目的条带,对获得的特异性片段回收、克隆、测序后进行序列同源性及系统进化分析。结果显示,郑州病样的病毒分离物外壳蛋白基因由774 bp组成,其核苷酸和氨基酸序列与To CV其他分离物同源性均在96%以上;进化分析表明,郑州分离物与河北、天津分离物亲缘关系最近。造成郑州番茄产区褪绿症状的病原为To CV。     

鸡新城疫病毒融合蛋白基因的克隆及进化分析

根据GeneBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对NDVLN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GeneBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.4%~99.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.4%~99.8%之间。     

球毛壳菌pdc基因克隆及生物信息学分析

利用BlastX将球毛壳菌（Chaetomium globosum）ESTs序列与GenBank的Nr数据库进行相似性搜索,获得含有丙酮酸脱羧酶基因（pdc）的2条ESTs（BP099214和BP113195）,以此设计引物,克隆获得球毛壳菌pdc基因的cDNA及DNA序列。cDNA和DNA序列长度分别为1725和1829bp,编码574个氨基酸的多肽,蛋白质分子质量63．38ku。蛋白质家族预测其属于焦磷酸硫胺素TPP家族。BlastP相似性分析表明,PDC氨基酸序列保守性不高,与其相似性最高的是柄孢霉的PDC（Podospora anserina,CAD60727）,相似性为79％。pdc基因的cDNA及DNA序列在GenBank上的登录号分别为EU304327,EU304326。