高度致弱的痘苗病毒——MVA的研究进展

1989年,WHO等国际组织提出要发展一种理想疫苗[1],使其具有安全、高效、多价、应用方便等特点,从而为疫苗的研究指明了方向.痘苗病毒一度曾作为天花疫苗使用,由于以痘苗病毒为载体构建的重组疫苗具有价廉、高效、易于构建多价疫苗等特点,被科学家们视为表达外源基因的首选载体之一.但是它也有两个主要缺点.其一,接种人体后会产生较重的局部反应,幼儿或患严重免疫缺陷的成人反应更明显.其二,机体内针对痘苗病毒的抗体会降低它的免疫效果.因此,增强痘苗病毒的安全性就成为痘病毒研究的当务之急.     

重组痘苗病毒载体研究进展

通过同源重组将外源基因插入到痘苗病毒基因组内,以痘苗病毒为载体使外源基因在动物细胞内表达以获得目的蛋白,从而达到免疫接种的目的.痘苗病毒有宿主范围广、允许插入外源基因片段长、可通过多种途径进行接种、能诱导体液和细胞免疫反应及易于增殖生产等优点,在疫苗研制中得到了广泛的应用.以痘苗病毒作为载体表达狂犬病病毒糖蛋白研制成的狂犬病疫苗已经在野生动物狂犬病控制中发挥了巨大的作用,用痘苗病毒研制的艾滋病病毒疫苗也已经进入了临床试验.     

重组辛德毕斯病毒E基因痘苗病毒的构建

为了构建表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒,本研究通过基因重组的方法将辛德毕斯病毒E基因及绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因分别连接至痘苗病毒转移载体pSTK,酶切鉴定得到阳性重组质粒pSTK-SINE-EGFP。采用脂质体转染的方法,将该重组质粒与痘苗病毒天坛株共转染BHK-21细胞,通过同源重组获得重组痘苗病毒。利用EGFP筛选阳性重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP,收集感染重组痘苗病毒的BHK-21细胞,SDS-PAGE电泳检测辛德毕斯病毒E基因在细胞中的表达情况,Western blot分析表达产物的免疫原性。结果证明辛德毕斯病毒E基因能在重组痘苗病毒vTTVV-SINE-EGFP中获得表达,且表达产物具有良好的免疫原性。表达辛德毕斯病毒E基因的重组痘苗病毒的成功构建,为研制辛德毕斯病毒活载体疫苗奠定了基础。     

四联重组痘苗病毒的构建及筛选

构建含黄热病毒E基因、汉坦病毒S基因、克里米亚-刚果出血热病毒M基因及炭疽杆菌POAX2基因的重组天坛株痘苗病毒。设计合成含外源筛选标记EGFP基因和4种拟插入外源基因的重组质粒,利用同源重组和荧光标记筛选技术并结合Cre/Loxp敲除系统,最终构建四联重组痘苗病毒。应用PCR对获得的重组痘苗病毒进行鉴定和遗传稳定性的检测,并在电子显微镜下观察其形态特征。构建含4种外源基因的重组痘苗病毒rVTT-C-4＋,该重组痘苗病毒在转录水平上具有良好的遗传稳定性,且于电镜下观察具备完整形态。成功构建四联重组天坛株痘苗病毒,为后续疫苗研究奠定了基础。     

表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒的构建与筛选

为了构建并筛选表达16型蓝舌病病毒(BTV-16)VP2蛋白的重组痘苗病毒rVTT-VP2,本研究通过同源重组的方法构建重组痘苗病毒,以TK基因缺失和EGFP绿色荧光为筛选标记,通过噬斑纯化法在BHK-21细胞中纯化10次,并连续传代20次来验证重组痘苗病毒遗传稳定性。PCR鉴定结果显示,VP2基因已整合到重组痘苗病毒基因组中,且未扩增出TK基因。荧光显微镜镜下观察,噬斑处均为表达绿色荧光蛋白的病变细胞。本研究成功构建了表达BTV-16 VP2蛋白重组痘苗病毒rVTT-VP2,为后期疫苗的研究奠定了基础。     

多联重组痘苗病毒的构建及鉴定

构建含有埃博拉出血热病毒(Ebola hemorrhagic fever virus,EHFV)小片段分泌蛋白S基因、马尔堡出血热病毒(Marburg hemorrhagic fever virus,MHFV)GP基因、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus,SNV)G2糖蛋白基因及非洲欧尼恩病毒(Africa O’nyong nyong virus,O’NNV)E2蛋白基因的重组痘苗病毒。设计含EGFP筛选标记和4种外源基因的穿梭质粒,并利用同源重组技术、荧光筛选技术和Cre/LoxP敲除系统,最终获得四联重组痘苗病毒。使用PCR方法鉴定重组痘苗病毒及其遗传稳定性;用透射电镜观察病毒形态。结果显示:所构建的多联重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+具有良好的遗传稳定性,并且具备痘苗病毒的完整形态。结果表明:成功构建了含有4种外源基因的重组痘苗病毒rVTT-J~-4~+,为后续多联疫苗的研究奠定了基础。     

乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗对猪体的免疫效果

重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE投入使用之前需要进行本体动物免疫和攻毒保护试验,本研究将重组痘苗病毒rVTT-JEVE进行仔猪免疫接种,分别在体液免疫及细胞免疫水平上评价其免疫效果,并检测攻毒后仔猪体内乙型脑炎病毒载量,分析讨论乙型脑炎重组痘苗病毒候选疫苗rVTT-JEVE对猪体的免疫效果。经2次仔猪免疫接种后,重组痘苗病毒rVTT-JEVE组的IgG抗体水平是商品疫苗SA-14-14-2组的1.5倍,显著高于SA-14-14-2组(P0.05),而且rVTT-JEVE组的中和抗体效价达到SA-14-14-2组的1.7倍,显著高于SA-14-14-2组(P0.05)。rVTT-JEVE组的T淋巴细胞刺激指数为SA-14-14-2组的1.6倍,显著高于SA-14-14-2组(P0.05)。本研究结果显示,rVTT-JEVE候选疫苗组和SA-14-14-2商品疫苗组JEV病毒载量均显著低于PBS对照组(P0.05),均可有效保护仔猪感染JEV。     

重组痘苗病毒作为疫苗抗原活毒载体前途广阔

1984年11月世界卫生组织及英、美等三个机构开会讨论了应用基因重组的痘苗病毒作为人和兽用活疫苗的研究进展。很多动物接种痘苗病毒能很好复制而未见持续自然传播,可作为疫苗载体,痘苗病毒DNA中有—28kb的区域切除后代以外源基因,所形成的痘苗新病毒仍能复制,其特点是易繁殖、很稳定、价格低、使用方便,一次接种即能获得长期免疫。迄今已成功的有动物的水泡性口炎、传染性胃肠炎等。含狂犬病毒表面糖蛋白基因的重组痘苗病毒,接种小鼠后产生高滴度中和抗体,并能抵抗街毒的脑内攻击;如经口免疫小鼠,也可产生保护。     

重组痘苗病毒TTVAC7理化特性

探讨重组痘苗病毒TTVAC7的理化特性,对重组痘苗病毒活载体疫苗的规模化生产、保存、运输和净化具有一定的指导意义。将重组痘苗病毒TTVAC7和天坛株痘苗病毒VTT经热、酸、碱、乙醚、氯仿、胰蛋白酶、紫外线照射及超声波破碎处理后,接种于BHK-21细胞,通过测定TCID50观察上述理化因子处理前后TTVAC7和VTT毒价的变化,并分析这些理化因子对TTVAC7和VTT的影响。结果显示,TTVAC7经55℃作用15min,VTT经55℃作用30min即可完全被灭活;在pH值3~9的范围内,pH值的变化不会引起TTVAC7和VTT病毒滴度的显著变化;紫外线垂直距离10、30cm照射病毒液60min,不能完全灭活病毒粒子;对氯仿敏感;经1%胰蛋白酶37℃处理60min,TTVAC7和VTT的病毒滴度下降2个滴度以上;对乙醚不敏感;经40、80Hz的非接触式超声处理60min,TTVAC7和VTT的病毒滴度下降低于2个滴度。结果表明,重组痘苗病毒TTVAC7和天坛株痘苗病毒VTT理化性质相似,均不耐高温,耐酸、碱、乙醚、紫外线及超声波,对氯仿和胰蛋白酶敏感。     

表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定

为探索猪痘病毒（swinepox virus,SWPV）作为猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基因,以猪痘病毒JX20G株为亲本病毒,采用同源重组技术分别构建了两株表达PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C。结果显示,重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C均成功表达了PCV2衣壳蛋白,表达的蛋白能与PCV2单克隆抗体6E12发生特异性反应;痘苗病毒启动子P28的启动效果明显优于P7.5,P28适合用于启动目的基因;利用重组猪痘病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫小鼠后,rSWPV11-28C疫苗组的PCV2抗体水平与某PCV2商品疫苗相当,该重组病毒的成功构建为PCV2相关疾病及其他疫病在猪群中的防控提供了新的方向。     

MDV—gB重组病苗病毒诱导免疫的检测及保护性

用MDV-gB重组痘苗病毒RVV-gB、HVT冻干疫苗、痘苗病毒WR株分别按试验程序对细胞免疫及体液免疫检测试验中的1日龄SPF鸡进行免疫接种，并于15日龄时对试验各组鸡用GA株强毒攻击，经IFA抗体检测，及以PHA为有丝分裂原的淋巴细胞转化检测，结果表明，重组病毒和HVT冻干疫苗免疫鸡均获得了较高保护，体液免疫效果差异不显著；细胞免疫效果在攻毒有差异不显著，但攻毒后第2d开始，RVV-gB免疫组鸡的淋巴细胞转化率明显高于HVT冻干疫苗免疫组鸡。     

表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定

为探索猪痘病毒(swinepox virus,SWPV)作为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基因,以猪痘病毒JX20G株为亲本病毒,采用同源重组技术分别构建了两株表达PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C。结果显示,重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C均成功表达了PCV2衣壳蛋白,表达的蛋白能与PCV2单克隆抗体6E12发生特异性反应;痘苗病毒启动子P28的启动效果明显优于P7.5,P28适合用于启动目的基因;利用重组猪痘病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫小鼠后,rSWPV11-28C疫苗组的PCV2抗体水平与某PCV2商品疫苗相当,该重组病毒的成功构建为PCV2相关疾病及其他疫病在猪群中的防控提供了新的方向。     

鸡瘟病毒载体研制及应用进展

鸡瘟病毒载体研制及应用进展袁世山，刘桂永，沈瑞忠，金虹，卢景良（中国农科院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室）重组疫苗特别是活病毒载体疫苗的出现，为改进现有常规疫苗带来了契机，痘苗病毒（ＶＶ）以其外一源基因容量大，忠实的翻译后处理而一度成为病...     

重组杆状病毒表达的EIAV Env蛋白与含有env基因重组痘苗病毒的联合免疫

目的：构建新型的马传染性贫血病毒（EIAV）的候选疫苗。方法：利用BAC-To-BAC杆状病毒表达系统,将中国马传贫驴白细胞弱毒疫苗（EIAVDLV）及其亲本株（EIAVLN）env基因导入到杆状病毒基因组中。转染昆虫细胞后,得到的重组病毒用SDS-PAGE和Western blot检测表达产物。以本实验室构建的含有EIAVEnv基因的重组痘苗病毒,单独或与重组杆状病毒表达的EIAVEnv蛋白联合免疫小鼠。结果：构建的重组杆状病毒能正确表达全长Env蛋白。与单独免疫组相比,联合免疫组免疫应答显著增强,其中中和抗体的滴度提高5—9倍。结论：含有EIAVEnv基因的重组痘苗病毒与Env蛋白抗原联合务埔．能够诱导高滴座的中和抗体．     

HIV—2gag基因在重组痘苗病毒中的表达

以痘苗病毒ＨＡ基因为侧翼，将ＨＩＶ－２ｇａｇ基因部分序列（简称Ｇ１）和全部序列（简称Ｇ２）分别插入牛痘病毒Ａ型包涵体（ＡＴＩ）和串联１０个（与ＨＡ基因反向）或１６个（与ＨＡ基因同向）痘苗病毒Ｐ７．５组成的复合型启动子下游，构建了４个重组痘苗病毒表达载体质粒。经脂质体转染、鸡红细胞吸附试验筛选和免疫荧光鉴定，获得４株能稳定表达目的蛋白的重组痘苗病毒。实验结果表明，以ＨＡ基因为侧翼构建重组病毒的重组率约为０．１％，阳性重组率为２５％～１００％。实验中还发现，以ＨＡ基因为侧翼的重组痘苗病毒能够引起细胞融合，其可作为筛选重组痘苗病毒的另一种标志。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果表明，表达的Ｇａｇ蛋白能被ＨＩＶ－２血清中的特异性抗体所识别，并能诱导小鼠产生抗ＨＩＶ－２Ｇａｇ抗体。     

禽痘病毒的分子生物学——Ⅱ禽痘病毒载体（续）

历史上，痘菌病毒（VacciniaVirus）的应用曾帮助人类消灭了灾难性的疾病一天花，时至八十年代初，当Moss和Paoletti的实验室各自独立地证实痘苗病毒基因组的标记拯救现象时，这一准备冬眠的病毒又呈现了新的活力，它被广泛用作外源基因的表达载体。十多年来，50余种原核、真核基因在其中获得表达，而且所构建的活载体疫苗一般都具有良好的免疫原性。然而，由于痘苗病毒在使用过程中能引起严重的副反应，以此为基础的重组疫苗并未能获准在实际中反应。八十年代后期，在兽医领域内开始开发宿主持异性的症病毒载体，禽痘病毒载体即应运而生…     

以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒转移载体的构建及鉴定

为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅡ和AftⅡ两个酶切位点.用于外源基因的插入.为检测禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt的有效性,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到该载体中构建转移载体pSY681-gfp-gpt-HA9,将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化后获得了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,为今后重组禽痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础.     

重组病毒载体疫苗的研究进展

随着分子生物学技术和遗传操作技术的广泛应用,重组病毒载体疫苗得到了很大的发展。除了以往被广泛应用的痘病毒和反转录病毒载体外,现在更多种类的病毒被修饰改造,以用于构建重组病毒疫苗。病毒载体疫苗能够克服传统疫苗的一些弊端,有助于区分野毒感染和疫苗接种,从而达到预防、治疗,甚至净化传染病的目的。文章描述了该领域的最新研究进展,旨在为新型疫苗的研制提供有价值的参考。     

首例人重组痘苗病毒实验室感染

当前 ,在美国等国家接种痘苗病毒预防天花来保护公众抵制生物恐怖袭击 ,已成为一个非常热门的话题 ;一些国家也推荐在实验室操作痘苗病毒或牛痘病毒的工作人员进行免疫 ,而通过实验室操作痘苗病毒受到感染被认为是不可能的。但最近据Journal of Investigative Dermatology杂志报道 ,在德国 Technical U niversity工作的一位 4 0岁的男性 ,在实验室操作痘苗病毒后 ,每只手的手指上都出现了痘样病变 ,而且通过微生物学和基因检测 ,病变就是由重组痘苗病毒引起的。该名男性曾在 1岁时接受过天花免疫 ,1 0岁时又免疫过 1次 ,但为什么仍然被感…     

分子生物学新技术在疫苗生产和疫病诊断中的应用

随着生物技术的快速发展,疫苗的生产发生了巨大变革,分子生物学技术已被大量应用于病原体的检测、研究、疫病的快速诊断,即:PCR(聚合酶链反应)技术、RT—PCR(反转录—聚合酶链反应)技术、基因芯片技术、荧光原位杂交技术的应用等。1基因工程技术疫苗1.1基因工程亚单位疫苗利用基因工程技术取出微生物中编码保护性抗原肽段的基因,与质粒等载体重组,导入受体菌(细菌、酵母)或细胞,使之高效表达,产生大量保护性肽段,提取后加入佐剂即成为亚单位疫苗。1.2基因工程活载体疫苗该苗又称重组活毒疫苗。通常以动物病毒弱毒或无毒株,如痘苗病毒、…