4种动物虫媒病病毒多重RT-PCR检测方法的建立

分别设计和合成4对特异性引物,通过对反应条件的优化,初步建立了鉴别蓝舌病病毒(BTV)、鹿流行性出血病病毒(EHDV)、水疱性口炎病毒(VSV)和赤羽病病毒(AKV)的多重RT-PCR检测方法,并对其特异性和敏感性进行了检测。结果表明,所设计的4对引物可对同一样品中的VSV、BTV、EHDV和AKV进行特异性扩增,所扩增的目的片段的长度分别为301、351、537、250bp。建立的四重RT-PCR检测方法能够检测出10-7稀释的细胞培养病毒液,4种病毒之间没有发生交叉反应,说明该检测方法特异性强,敏感性较高。所建立的多重RT-PCR方法可用于上述4种动物虫媒病病毒的快速鉴别诊断,在动物检疫、临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。     

几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示：建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^1.70～10^2.08copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系IV型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量...     

4种重要虫媒病的核酸液相芯片高通量检测方法的建立

为建立可检测鹿流行性出血热病毒(EHDV)、阿卡斑病毒(AKV)、蓝舌病病毒(BTV)和水泡性口炎病毒(VSV)的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中BTV的VP7基因、EHDV的VP7基因、AKV的N基因和VSV的NP基因序列进行序列分析,设计针对这些基因的特异性探针并标记生物素,分别与不同编号的荧光编码微球偶联后再与这些病毒相应基因的PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪(Liquichip 200)检测荧光信号建立了以上4种虫媒病的快速液相芯片检测方法。检测结果显示,该方法具有较好的特异性,偶联特异性探针的微球只与相应的病毒基因的PCR产物反应,而不与其他虫媒病病毒反应;检测灵敏度达到50~100个TCID50。本研究建立了可以同时检测鹿流行性出血热病毒、阿卡斑病毒、蓝舌病病毒和水泡性口炎病毒的快速高通量液相芯片技术,为其他类似病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。     

施马伦贝格病毒套式RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的施马伦贝格病毒S基因序列,设计特异性引物,构建施马伦贝格病毒S基因重组克隆质粒作为阳性对照,经各反应条件的优化以及特异性、敏感性和重复性试验,建立了施马伦贝格病毒套式RT-PCR检测方法。结果表明,本研究建立的套式RT-PCR方法可特异性的检测施马伦贝格病毒,且与BTV、EHDV、AKV、BVDV、IBRV等其他病毒的核酸不发生交叉反应。每个反应可检测到相当于6.65×102 copies/μL施马伦贝格病毒重组克隆质粒。与传统的病毒分离及血清学方法相比较,不但耗时短(仅需5h),而且费用低廉。本研究建立的套式RT-PCR方法具有特异、敏感、重复性好、快速、费用低廉等优点,是施马伦贝格病毒快速初筛的良好方法。     

鉴别牛5种重要病毒的LAMP-基因芯片方法的建立

为建立牛的主要疫病的快速、准确及高通量鉴别诊断技术,以赤羽病病毒(AKV)、牛白血病病毒(BLV)、蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和小反刍兽疫病毒(PPRV)5种牛传染病病原为研究对象,将LAMP技术与微流控芯片技术有机结合,建立了相应的基因芯片检测技术,并优化了该基因芯片的反应条件。结果表明,建立的基因芯片可同时检测上述5种病原,特异性好,60 min反应时间即可给出检测结果。其中AKV和PPRV的敏感性为10~3 copies/μL,BLV的敏感性为10~5 copies/μL,BTV和BVDV的敏感性为10~2 copies/μL,与LAMP检测的敏感性一致。成功建立了基于LAMP技术的5重RT-LAMP基因芯片,可同时快速准确检测上述5种病毒,为口岸检疫探索出一种能快速、高通量检测动物疫病的方法。     

小反刍兽疫疫苗毒株与强毒株的鉴别性荧光RT-PCR检测方法的建立

对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行分析,设计引物与探针,建立PPRV通用型与Ⅱ系疫苗毒特异型二重实时荧光RT-PCR方法,同时建立针对PPRVIV系强毒株的特异型荧光PCR方法。特异性试验和灵敏度试验表明：建立的二重荧光RT-PCR方法可特异性检测PPRV病毒,其HEX信号通道（通用型）和TAMRA信号通道（Ⅱ系疫苗毒特异型）的检测灵敏度分别可达10^1 TCID50/mL和10^2 TCID50／mL,完全满足PPRV的检测要求。用二重荧光RT-PCR方法对西藏采集的14份羊血清样品进行检测,并用建立的Ⅳ系强毒株特异型荧光PCR方法对二重荧光RT-PCR的检测效果进行评估,结果显示,该方法可有效甄别PPRV强毒株和疫苗毒株,避免假阳性结果的出现。     

牛病毒性腹泻病毒和牛轮状病毒TaqMan二重实时荧光RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻病毒（BVDV）5′端非编码区和牛轮状病毒（BRV）VP6基因序列,设计特异性引物和探针。通过对引物和探针浓度、Mg2＋浓度、dNTP浓度和Taq酶用量以及反应条件等因素的优化筛选,建立了能同时鉴别BVDV和BRV的二重荧光RT-PCR方法。该方法特异性好,与其他病原如CSFV、MB和IBRV不发生交叉反应;敏感性高,能够检测100个BVDV RNA和100个BRV RNA;稳定性好,批内重复和批间重复变异系数小;干扰性试验表明该方法能同时检测2个模板的不同浓度组合。本研究建立的二重荧光RT-PCR方法可用于BVDV和BRV检测,具有特异、敏感、快速、稳定等优点,是BVDV和BRV基础研究、流行病学调查和临床检测的良好工具。     

鹿流行性出血病RT-LAMP检测方法的初步建立

本实验应用反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）建立了一种快速、灵敏、特异的检测鹿流行性出血病病毒（EHDV）的方法。针对EHDV-VP7基因,在基因的保守区域设计两对特异性引物,通过优化反应温度、Mg2＋浓度等,建立了EHDV RT-LAMP检测方法。实验结果表明,建立的EHDV RT-LAMP检测方法的灵敏度是普通荧光RT-PCR方法的1 000倍,且能区分EHDV、AKV和VSV病毒。     

蓝舌病、口蹄疫、小反刍兽疫和水泡性口炎多重PCR检测方法的建立

为建立一种检测并鉴别蓝舌病病毒、口蹄疫病毒、小反刍兽疫病毒和水泡性口炎病毒感染的方法,针对蓝舌病病毒NS3基因、口蹄疫病毒3D基因、小反刍兽疫病毒N基因和水泡性口炎病毒N基因序列设计引物,优化反应体系和扩增条件,建立了一种同时检测4种病毒的多重PCR方法。对建立的多重PCR检测方法的特异性及敏感性进行检验,结果表明建立的多重PCR检测方法敏感性强、特异性良好,对4种病毒的最低检出限分别为PPRV 103 copies/μL、BTV 103 copies/μL、VSV 103 copies/μL和FMDV 102 copies/μL。本方法的建立对临床感染蓝舌病等4种病毒的病畜进行快速检测具有十分重要的意义。     

猪传染性胃肠炎病毒与猪流行性腹泻病毒TaqMan二重荧光RT-PCR检测方法的建立

根据猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的S基因序列和猪流行性腹泻病毒(PEDV)的N基因序列,设计特异性的引物和探针。通过对引物和探针浓度等反应液用量以及反应条件等因素进行优化试验,建立了能同时鉴别检测TGEV和PEDV的二重荧光RT-PCR方法。用该方法同时检测其他病原如Po RV、PCV和CSFV时不发生交叉反应,特异性好;较普通PCR均高出3个数量级的敏感性,能够检测10 TGEV和10 PEDV拷贝数,敏感性高;组内重复和组间重复试验结果变异系数小,稳定性好;同时检测2个模板的不同浓度组合试验,干扰性小。本试验建立的二重荧光RT-PCR方法可用于TGEV和PEDV的鉴别检测,且具有特异、敏感、稳定、快速等优点,为进一步应用于TGEV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定了基础。     

蓝舌病毒群特异性RT—PCR检测技术及其应用

目的:建立一种适于蓝舌病毒(BTV)群特异性基因检测的RT-PCR方法。方法:根据本实验室设计的一对BTVNS1基因通用型检测引物建立BTV群特异性RT-PCR检测技术;对不同血清型BTV及鹿流行性出血热病毒(EHDV)进行检测,验证其特异性;同时,利用该方法检测血清模拟样品及抗病毒血清样品。结果:所设计的检测方法特异性好,与EHDV无交叉反应,可检测至少17个血清型BTV,并能有效检出不同病毒浓度的模拟样品及不同型的血清样品。结论:建立的RT-PCR方法可用于BTV群的特异性通用检测。     

A multiplex PCR for simultaneous detection and differentiation of North American serotypes of bluetongue and epizootic hemorrhagic disease viruses

In the present study, a multiplex RT-PCR-based assay for simultaneous detection and differentiation of North American serotypes of bluetongue (BT) virus (BTV) and epizootic hemorrhagic disease (EHD) virus (EHDV) in cell culture and clinical samples was developed. Two pairs of primers (B1 and B4) and (E1 and E4) were designed to hybridize to non-structural protein 1 (NS1) genomes of (BTV-11) and (EHDV-1), respectively. The multiplex PCR-based assay utilized a single tube-PCR amplification in which EHDV and BTV primers were used simultaneously in a multiplex format. The BTV primers generated a 790 base pair (bp) specific PCR product from RNA samples of North American BTV serotypes 2, 10, 11, 13 and 17; whereas EHDV serotypes 1 and 2 or total nucleic acid extract from non-infected baby hamster kidney (BHK) cells failed to demonstrate the 790bp specific BTV PCR product. Likewise, the EHDV primers produced a 387bp specific PCR product from RNA samples of EHDV serotypes 1 and 2, but not from BTV serotypes 2, 10, 11, 13, 17 or from total nucleic acid extract of BHK cell controls.Two pairs of nested primers (B2 and B3) and (E2 and E3), internal to the annealing sites of primers (B1and B4) and primers (E1 and E4), produced a 520bp specific BTV and a 224bp specific EHDV PCR product from BTV and EHDV first amplification products, respectively. These nested amplifications increased the sensitivity of the PCR assay and confirmed the specificity of the first amplified EHDV or BTV PCR products. The described multiplex RT-PCR-based assay could be used to facilitate rapid detection and differentiation of North American BTV and EHDV serotypes and to provide a valuable tool to study the epidemiology of these orbivirus infections in susceptible animal populations.     

Development of PCR-based tests for the identification of North American isolates of epizootic haemorrhagic disease virus.

A serogroup-specific polymerase chain reaction (PCR) assay and isolate identification strategies (restriction endonuclease analysis (REA) and nucleotide sequencing) were developed for the detection of North American isolates of epizootic haemorrhagic disease virus (EHDV). PCR primers (EHDV-pr4, EHDV-pr5) were designed to hybridize to the L3 gene of a North American isolate of EHDV serotype 1. Total nucleic acid was extracted from preparations of infected tissue culture and PCR was performed using a cDNA-PCR kit, according to the manufacturer's specifications. The PCR assay generated a 459 base pair product from North American isolates of EHDV serotypes 1 and 2, while bluetongue virus (BTV) serotypes 10, 11, 13, and 17, and cell controls, failed to demonstrate PCR products. Slight modifications allowed for the PCR detection of EHDV-1 and -2 in white-tailed deer blood (Odocoileus virginiatus); PCR fragments were not amplified from uninfected deer blood. A number of restriction endonucleases and sequencing primers were evaluated for their utility in isolate identification experiments. Specifically, REA employing HincII and cycle sequencing with an internal primer (EHDV-1-pr3) proved most successful for identifying isolate-specific genome markers. The techniques presented are expected to prove valuable for rapid and specific detection of possible future EHDV incursions in wild and domestic animal species.     

帕利亚姆血清群病毒一步法RT-PCR检测技术的建立

帕利亚姆血清群病毒(PALV)在我国广泛流行,给我国牛羊养殖业健康发展构成了严重威胁,目前国内尚无PALV核酸检测方法的报道。本研究根据流行于我国的中山病毒(CHUV)、Bunyip Creek virus(BCV)和D’Aguilar virus(DAV)3种血清型PALV的Seg-7保守基因序列,设计针对PALV的群特异性RT-PCR扩增引物,通过反应条件优化,建立了PALV的一步法RT-PCR检测方法,其最佳引物浓度为0.8μmol/L;最佳退火温度为56℃。对该方法进行特异性试验,结果显示该方法可特异性的检测出CHUV、BCV和DAV核酸,而对环状病毒属的蓝舌病病毒、流行性出血病病毒、非洲马瘟病毒和广西环状病毒的检测结果均为阴性;敏感性试验结果显示,该方法对RNA标准品的最低检测限为6.9×10~1拷贝/μL。利用该方法检测血液样品,结果显示该方法检测结果与病毒分离结果基本一致。本研究建立的PALV一步法RT-PCR方法具有特异性强、敏感度高等优点,为开展PALV感染疫病诊断与流行病学研究提供了技术保障。     

光生物素cDNA探针对体内外蓝舌病病毒感染的检测

蓝舌病病毒(BTV)基因的第三片段(RMA_3)在不同型间有较高的同源性.用光生物素标记的其cDNA重组体pC7,检测2～22型BTV BHK细胞培养物全部为阳性,而相关病毒EHDV_1、EHDV_2和Ibraki病毒为阴性;同一探针检测17个型BTV攻毒羊的全血样品均为阳性,未感染的正常羊血细胞和BHK细胞培养物样品均为阴性.     

Epizootic hemorrhagic disease virus infection of type I interferon receptor deficient mice

Type I interferon receptor deficient (IFNAR(-/-)) mice were infected with an Israeli isolate of serotype 7 of epizootic hemorrhagic disease virus (EHDV; Orbivirus, Reoviridae). Two out of two mice that received 5×10(5) 50% tissue culture infectious doses (TCID(50)) by intraperitoneal injection died or were euthanized in a moribund state on day 5 after infection. One mouse out of three that had been inoculated with 5×10(2) TCID(50) died on day 7 while the remaining mice did not show any clinical signs and survived until the end of the experiment. Spleens of all dead mice were highly positive in an EHDV real-time RT-PCR (quantification cycle values ≤15) and contained ≥10(5.8) TCID(50) of virus per ml of homogenate. The viral RNA content and virus titer in the spleens of the two surviving mice, on the other hand, were over 100-fold lower. Different from data reported for BTV, the outcome of EHDV infection of IFNAR(-/-) mice is dose-dependent and subclinical infections can occur.     

猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。     

鹿流行性出血病病毒双抗夹心ELISA方法的建立

为建立鹿流行性出血病病毒(EHDV)病原学检测方法,用纯化的抗EHDV特异性单克隆抗体包被ELISA板,用兔抗EHDV IgG作为夹心抗体,IgG作为夹心抗体建立EHDV双抗夹心ELISA方法,并对该方法的特异性和敏感性进行了试验.用ELISA分别检测EHDV、蓝舌病病毒(BTV)、水疱性口炎病毒(VSV)、赤羽病病毒...